加味保元汤对束缚应激大鼠海马CA3区神经元损伤的影响

刘 超，潘晓艳，朱慧娟，袁梦丹，蔡红阳，孙 莉

（大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

0 引言

海马是应激领域研究的一个重点，有研究表明慢性应激可以损伤海马神经元[1-3]。其损伤机制可能是在应激状态下，下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴持续激活，引起血浆糖皮质激素（GC）释放增多，作用于海马区GC受体，导致海马CA3区神经元发生萎缩、甚至死亡[4]。前期研究显示中药加味保元汤具有抗应激作用[5-7]，本实验采用慢性束缚应激大鼠模型，进一步观察加味保元汤对慢性束缚应激大鼠海马 CA3区神经元损伤的保护作用，以探索加味保元汤抗应激作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组及处理

健康雄性SD大鼠30只，体重180～220g，清洁级，由大连医科大学实验动物中心提供。随机等分为5组：正常对照组、模型组、加味保元汤高剂量组、加味保元汤中剂量组和加味保元汤低剂量组。

1.1.2 实验仪器与试剂

显微摄像机：OLYMPUS-BX63；石蜡切片机：LEICA RM2255。

加味保元汤由人参、黄芪、肉桂、甘草、五味子分别以5：6：5：3：5比例构成，水提取物由本校中药研究室制备。

1.2 方法

1.2.1 应激模型制作

正常对照组，不给予任何刺激，其它各组大鼠每日束缚 1次，每日开始时间及束缚时间不同，第 1天为4 h，其后每次增加30～60 min，连续3周。束缚期间禁食水。加味保元汤高、中、低剂量组束缚前分别给予300 mg/kg体重、200 mg/kg体重和100 mg/kg体重加味保元汤水提取物灌胃；模型组，给予束缚制动刺激不给予中药，但束缚前给予等量生理盐水灌胃；正常对照组，不给予任何刺激，但以等量生理盐水灌胃。

1.2.2 苏木素-伊红染色

光镜下观察各组大鼠海马CA3区神经元形态、结构：实验结束后，各组大鼠分别用 10%水合氯醛0.4 g/kg体重腹腔注射麻醉，先后用冷生理盐水和4%多聚甲醛主动脉灌流固定，继之剥取脑块在4%多聚甲醛固定过夜，然后乙醇脱水，二甲苯渗透透明，石蜡包埋切片，片厚5 μm。苏木素-伊红染色，中性树胶封固。然后光镜下观察各组大鼠海马神经元形态、结构变化，并拍摄图片。

2 结果

海马CA3区神经元，正常对照组：锥体细胞排列整齐、密集，细胞有光晕，胞体呈椭圆形，胞膜完整，胞质均匀透亮，核膜清楚，胞核清晰；模型组细胞排列稀疏,锥体细胞数明显减少，胞体膨胀，胞膜不完整，胞质不均匀，核膜不清，胞核固缩；加味保元汤中剂量组锥体细胞排列较整齐、较密集，细胞有光晕，胞膜较完整，胞体呈椭圆形，胞质较均匀，胞膜较完整，核膜较清，胞核较清晰，与正常组比较接近；加味保元汤高、低剂量组锥体细胞排列稀疏,锥体细胞数减少，胞体膨胀，胞膜不完整，胞质不均匀，核膜不清，胞核固缩。以上结果说明束缚应激对大鼠海马CA3区神经元有明显损伤，中剂量加味保元汤对其损伤有明显保护作用。CA1区无明显变化，结果见图1-图5：

图1 正常对照组大鼠海马CA3区神经元×200

图2 模型组大鼠海马CA3区神经元×200

图3 加味保元汤高剂量组大鼠海马CA3区神经元×200

图4 加味保元汤中剂量组大鼠海马CA3区神经元×200

图5 加味保元汤低剂量组大鼠海马CA3区神经元×200

3 讨论

应激是指机体对内外环境刺激因素所做出的适应性反应。过度应激可引起机体下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴持续激活，下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)释放增多，进而促使垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)释放，ACTH作用于肾上腺皮质，引起 GC释放增多，从而引起神经内分泌紊乱，并造成中枢神经系统损伤和功能紊乱。

在中枢神经系统中，海马是与认知行为功能密切相关的重要脑区，由于富含 GC受体，而且是中枢GC受体含量最高的脑区，所以应激时，海马区极易选择性地受到高浓度GC的攻击，导致海马器质性损害[4]。

已有研究表明慢性应激可以损伤海马神经元[1-3]。且研究显示慢性束缚应激主要使大鼠海马CA3区在形态、结构上出现一系列损害：锥体细胞数减少，顶树突缩短，电镜下细胞核固缩，核膜皱缩，线粒体脊模糊，空泡样变性，粗面内质网模糊不清等，而不发生在 CA1区[8]。本实验结果也清楚地显示模型组大鼠海马CA3区锥体细胞排列稀疏，锥体细胞数减少，胞体膨胀，胞膜不完整，胞质不均匀，核膜不清，胞核固缩；CA1区无明显变化，与文献资料相符合。

慢性应激致海马损伤的机制尚不十分清楚，目前许多研究者认为高糖皮质激素（GC）血症可能是其中的主要原因[2,9-10]。Magarios等研究发现长期暴露于高水平皮质酮条件下会导致大鼠海马CA3区锥体细胞减少，原因之一是皮质酮可能通过对大鼠海马神经元受体的作用影响神经元的功能[11]。本次实验结果显示束缚应激致海马CA3区神经元的损伤，也可能与血清皮质酮浓度升高有关。其机制还需进一步研究。

应激机制研究较多，但抗应激药物的研究不多，目前中药抗应激作用研究正在引起重视。有研究表明中药对慢性应激大鼠海马神经元具有保护作用[12,13]，但尚未见加味保元汤对慢性应激大鼠海马神经元损伤影响的研究报道。

保元汤由人参、黄芪、甘草、肉桂等四味药组成，具有补气温阳之功效。《张氏医通》将此方列为补气类诸方之首，认为补中益气汤、升阳益胃汤、十全大补汤、人参养营汤均由该方变化而成，可见，保元汤实属一补气之祖方。因五味子具有宁心安神之功效[14]，所以，我们在保元汤中加入五味子，作为本研究的加味保元汤使用。前期研究表明，加味保元汤具有一定的抗应激作用[4-6]。本次实验结果显示，加味保元汤中剂量组大鼠海马CA3区神经元形态、结构接近正常对照组，与模型组比较损伤较小，说明加味保元汤对慢性束缚应激大鼠海马CA3区神经元损伤有一定的保护作用，关于加味保元汤抗应激作用机制还需进一步研究。

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