乙酰水杨酸（阿司匹林）体外对流感病毒H1N1的抑制作用

丁 宁，卢 芯，郑丛龙，韦淳巍，许梦亭，向 敏，林雨馨

（大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

0 引言

流感病毒（influenza virus）是单负链RNA病毒，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的一种。通常分为人类和动物流感病毒两大类。其中人类流感病毒据其病毒核蛋白的抗原性可分为三类：A（甲），B（乙），C（丙）。由于流感病毒是以呼吸道传播为主，预防困难，曾多次造成了全球范围的大流行[1,2]。据统计平均每一年因感染流感病毒直接造成15000人死亡，另一方面因流感间接致死的也高达500000人。迄今为止全球范围内还没有特异的流感防治药物。虽然目前普遍认为可缓解病人的发病率及死亡率的措施是接种流感疫苗，但由于流感病毒变异迅速的特性，针对其有效的疫苗研制将需要几个月，所以易感人群不能及时得到接种。另一方面现在临床常用于治疗流感的药物主要是奥司他韦（达菲）、金刚烷胺、扎那米韦等，但目前使用均发现这些药物存在不同程度的耐药现象[2]。所以近年来基础及临床研究者都在积极寻找针对流感防治的有效药物和方法，是微生物研究领域重中之重。

乙酰水杨酸（Acetylsalicylic Acid）俗名阿司匹林（AS），又称醋柳酸,是分子量 180.16白色针状或板状结晶或结晶性粉末。无臭，微带酸味。在干燥空气中稳定，遇潮则缓慢水解成水杨酸和醋酸。为临床常用解热镇痛药，药理作用主要为：消炎、解热、止痛及抗风湿作用，其本身还有对血小板凝集的抑制作用[3]。本文主要讨论阿司匹林在体外对流感病毒H1N1的抑制作用及其作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和病毒株

细胞株：人肺癌细胞（A549），由大连市疾控中心惠赠，传代培养液氮保存。

病毒株：H1N1流感病毒，血凝效价(1:512)。中科院武汉市病毒所惠赠，鸡胚接种传代液氮保存。

1.1.2 主要试剂

乙酰水杨酸（AS）：Sigma产品；RPMI1640：含有10%的胎牛血清；RPMI1640维持液：含2%的小牛血清；神经氨酸酶活性检测试剂盒：江苏碧云天。

1.1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱：美国NUAIR，型号NU-5500E；超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司，型号BCN-1360B；倒置显微镜：日本 OLYMPUS，型号CKX44。

1.2 实验方法

1.2.1 红细胞凝集（HA)试验检测AS对H1N1的血凝效价影响

将等体积的0.5 mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mL AS溶液与H1N1病毒液分别作用90 min，检测各组病毒血凝效价。用于检测AS对H1N1引起的红细胞凝集是否有抑制作用。

1.2.2 AS对H1N1神经氨酸酶活性抑制作用

按照神经氨酸酶试剂盒操作要求，于室温条件下1 mg/mL及5 mg/mL的AS分别作用于H1N1病毒60min（同时设阳性和阴性对照组），加荧光酶作用底物混匀后，37℃孵育20 min。设立发射波长和激发波长为460 nm和355nm，测定荧光值后计算病毒对神经氨酸酶活性的抑制率。

1.2.3 鸡胚接种法测定AS对H1N1病毒的抑制作用

1.5 mL EP管中分别将流感病毒液(效价为1:512)与等体积蒸馏水、AS溶剂及AS溶液（10 mg/mL）充分混合室温作用2 h。分别取100 μL上述三种病毒混合液注射至鸡胚尿囊腔中，严格遵守无菌操作。37℃温箱孵育72 h后取出鸡胚，置于4℃冰箱过夜，次日采集鸡胚尿囊液，测定各个浓度AS对流感病毒的杀伤作用。

2 结果

2.1 红细胞凝集试验测AS对H1N1血凝效价的影响

如图1所示，病毒与0.5 mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mLAS分别相互作用后的血凝效价分别为1:512、1:256、1:64和低于 1：2。结果表明，AS对 H1N1表面的血凝素活性具有抑制作用，且作用比较显著。

图1 HA凝集抑制实验检测AS对H1N1的血凝效价的影响

2.2 AS对病毒H1N1神经氨酸酶活性的抑制作用

如图2所示，AS作用浓度为1 mg/mL时作用60 min后对 H1N1病毒神经氨酸酶活性的抑制率大于40%，5 mg/mL的AS作用60 min后神经氨酸酶活性的抑制率大于 80%，而病毒组的抑制率小于 20%，AS组与病毒对照组差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，AS阻断病毒对细胞的感染的机制是通过抑制H1N1包膜上的神经氨酸酶活性来实现的。

图2 AS对H1N1病毒神经氨酸酶活性的抑制作用

2.3 鸡胚接种试验检测AS对流感病毒的灭活作用

如图3所示，AS作用流感病毒H1N1后感染鸡胚，收集尿囊液，血凝试验检测其病毒液效价均小于1:2，检测溶剂对照组和病毒组效价均为1:512。实验结果表明，AS在体外浓度为10 mg/mL能有效抑制病毒增值。

图3 鸡胚培养法检测AS对流感病毒H1N1的灭活作用

3 讨论

本实验结果提示，流感病毒在AS作用下，血凝素对红细胞的凝集能力以及神经氨酸酶的活性都有明显的抑制作用。AS体外抗流感病毒作用的一个重要的机制可能是AS对流感病毒中这两种蛋白质的直接作用。目前研究认为流感病毒感染宿主细胞时流感病毒H1N1血凝素和神经氨酸酶起到关键作用，对这两种蛋白功能产生的抑制，将有效阻止其感染宿主细胞。另一方面鸡胚接种实验则表明，乙酰水杨酸在浓度为10 mg/mL时对流感病毒H1N1有直接杀灭的作用。

对于加强临床流感病毒感染预防工作而言，本实验中发现AS对流感病毒具有直接杀灭作用具有重要意义[4]。AS在临床各科室常用于消炎、解热、止痛、抗风湿及抗凝，局部使用无明显毒副作用（过敏反应除外）；尤其近年研究显示其对于消化道肿瘤、艾滋病毒均有一定抑制作用，使得人们对其药物作用机理的研究引发起新的热潮。查阅文献表明，其使用浓度均高于本研究中乙酰水杨酸对流感病毒作用的剂量[2,5]。因此，本课题组将应用分子生物学等手段进一步深入研究AS对病毒直接灭活的作用机制。

[1]Fedso DS. Vaccine development for an imminent pandemic:why we should worry, what we must do [J]. Hum Vaccine,2006, 2(1): 38-42.

[2]Alan WH. Vaccines for pandemic influenza: The history of our current vaccines, their limitations and the requirements to deal with a pandemic threat [J]. Ann Acad Med Singapore,2008, 37(6): 510-517.

[3]张晓冬. 阿司匹林的药理特性及其临床应用[J]. 黑龙江科技信息, 2011(04): 30.

[4]林雨馨, 王兆雪, 杨喆东, 等. N-乙酰半胱氨酸体外对流感病毒H1N1的抑制作用[J]. 中国微生态学杂志, 2014(02):112-117.

[5]汤玲珍. 阿司匹林在H2O2诱导的人黑素细胞氧化应激损伤中的作用及机制研究[D]. 第四军医大学, 2012.