虫草复合营养液对过氧化氢致PC12细胞损伤的保护作用研究

郝春艳

（辽宁医学院附属第一医院 护理部，辽宁 锦州 121001）

虫草复合营养液对过氧化氢致PC12细胞损伤的保护作用研究

郝春艳

（辽宁医学院附属第一医院 护理部，辽宁 锦州 121001）

目的研究虫草复合营养液对过氧化氢损伤的PC12细胞的保护作用。方法P12细胞分为阴性对照组、造模组、低浓度组（1%虫草复合营养液）、中浓度组（3%虫草复合营养液）和高浓度组（5%虫草复合营养液），培养24h后除阴性对照组外，其他各组加入H2O2继续培养24h，比较各组细胞存活率、LDH活性以及NO含量。结果造模组存活率为（62.8±4.2）%，阴性对照组存活率为（100.0±1.7）%，造模组显著低于阴性对照组（P＜0.01），加入复合营养液组细胞存活率较造模组显著升高（P＜0.01），细胞LDH水平以及NO含量，造模组与阴性对照组比较，均显著高于阴性对照组（P＜0.01），加入复合营养液后，LDH水平以及NO含量较造模组显著下降（P＜0.01）。结论虫草复合营养液对氧化应激损伤的PC12细胞具有保护作用。

虫草复合营养液；过氧化氢；P12细胞

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株，由上海艾研生物科技有限公司提供，虫草复合营养液由本实验室配制，主要成分为虫草、猴头、灵芝。配制方法：3种食用菌发酵后提取发酵液及菌丝体，混合，粉碎，胶体磨破碎，离心，超声波处理，获得发酵液及菌丝体混合物。NO试剂盒（拜力生物），LDH试剂盒（上海谷研试剂有限公司）。PT-3502型酶标仪（北京普天），TGL-16M低温离心机（驰骋华星科技有限公司），BSC-1300IIA2生物安全柜（百典），Touch190 CO2培养箱（瑞士康科技），S-2低压吸引器（宁波戴维医疗器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试剂及培养基配制：配制浓度10mM的过氧化氢溶液。DMEM高糖培养基，10%高渗盐水，5%FBSDMEM培养基，4℃保存。

1.2.2 细胞培养：将PC12细胞置于10%HS，5%FBSDMEM培养基进行培养。细胞从液氮罐中取出，解冻，吸出细胞悬液，加入培养基，吹打混匀，离心后，弃去上清，再次加入培养液，37℃，5%CO2条件下培养。

1.2.3 分组：低剂量组加入1%的复合营养液，中剂量组加入3%的复合营养液，高剂量组加入5%的复合营养液，另设H2O2造模组和阴性对照组。取对数生长期的细胞，配制成1×105个／mL，接种于48孔细胞培养板中，加入不同浓度的复合营养液，造模组和阴性对照组加入PBS液。培养24 h。取10 mM过氧化氢溶液16mL，加PBS液24mL，配制10mM浓度，除阴性对照组外，将配制好的H2O2加入各组，使终浓度为400 nM，继续培养24 h。

1.3 检测指标 MTT法检测各组细胞的存活率，酶标仪550 nm处测定OD值，计算存活率。检测细胞LDH活性，用以反映细胞的受损情况，440 nm，测定吸光度，计算LDH活力。测定细胞NO含量，洗取细胞上清液，通过OD值计算上清液中NO的含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0对数据进行分析，正态计量资料采用“±s”表示，多组间比较采用F检验以及t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞存活率比较 造模组细胞存活率显著低于阴性对照组（P＜0.01），加入复合营养液后，细胞存活率较造模组显著升高（P＜0.01），并且随着药物浓度的增加，细胞的存活率也逐渐升高（P＜0.01，见表1）。

表1 各组细胞存活率比较Tab.1 Comparison of cell viability in each group

2.2 各组细胞LDH活性比较 造模组LDH水平较阴性对照组显著升高，而加入复合营养液组LDH水平较造模组显著下降（P＜0.01）。但是随着复合营养液浓度的增加，LDH水平有所升高，这可能与复合营养液浓度升高后对细胞有一定的损害，而导致部分细胞LDH渗漏有关（见表2）。

表2 各组细胞LDH活性比较Tab.2 Comparison of LDH activity in each group

2.3 各组细胞上清液NO含量比较 造模组上清液NO含量较阴性对照组显著升高（P＜0.01），加入复合营养液组NO含量较造模组显著下降（P＜0.01），并且随着浓度的增加，下降幅度越大（见表3）。

表3 各组上清液NO含量比较Tab.3 Comparison of NO in each group

3 讨论

虫草属于寄生真菌的一种，隶属于子囊菌亚门、核菌纲、肉座菌目，目前发现的已经有400多种，其中许多种类都包含有重要的要用价值。其在中医中的应用历史悠久，具有低脂、高蛋白、低热等优点［4］。大量研究显示虫草具有抗肿瘤、提高免疫力、降低血脂、调节代谢等作用［5］。其通过提高单核-巨噬细胞的吞噬作用、促进器官的蛋白更新等作用调节免疫功能。虫草还能够提高血清IgM的水平、IgG的水平，从而调节体液免疫［6］。

本研究中所采用的虫草复合营养液主要成分为虫草、灵芝以及猴头菌。猴头菌和灵芝也是属于我国传统上名贵的食用菌种。猴头菌具有促进神经生长因子的表达、抗氧化、提高免疫力、抗肿瘤等作用。虫草富含虫草素、多糖、虫草酸等，对抗肿瘤、提高免疫力、促进内循环等具有重要的作用。灵芝富含灵芝多肽和灵芝多糖，具有延缓衰老、抗肿瘤的作用。

脑组织中脑神经元的膜结构由大量的不饱和脂肪酸，脑组织中铁离子的浓度高，并且抗氧化酶水平较低，因此脑组织更容易遭受反应性氧化的损伤。研究显示多种神经退行性疾病与氧化应激相关，包括帕金森病和阿尔兹海默病［7-8］。PC12细胞源于神经系统外胚层，其特征与多巴胺能神经元相似，因具有可传代的优点，因此广泛被用于神经系统相关领域的研究。本研究目前使用的PC12细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株。

神经退行性病变是困扰老年患者的主要疾病，包括帕金森病以及阿尔兹海默病，目前尚无有效的治疗方法。研究显示当神经细胞受到反应性氧化攻击时，神经细胞会发生凋亡，导致神经元网络发生功能紊乱，最终导致神经退行性疾病［9］。阿尔兹海默病与脑神经细胞突触退变以及神经元的死亡具有密切的关系，膜脂质大量不饱和脂肪酸发生过氧化反应，导致细胞膜运输ATP酶、葡萄糖以及谷氨酸转运子的功能损伤，细胞膜发生去极化，ATP耗竭，钙离子大量内流，导致线粒体功能障碍，从而导致β-淀粉样蛋白的堆积［10-11］。帕金森病的发病机制是多巴胺能神经元发生氧化应激，线粒体功能障碍，而氧化应激是导致帕金森病患者黑质神经元死亡的主要原因［12］。

H202广泛用于抗氧化的研究中。多巴胺氧化、淀粉蛋白聚集、脑缺血再灌注等均可产生大量的H202，而H202还可进一步转化为OH-，其毒性更大，可通过氧化神经细胞膜中的不饱和脂肪酸脂质而使细胞膜遭到破坏，还通过损伤DNA、蛋白质等诱导细胞凋亡［13］。因复合营养液中既含有促进细胞生长的成分，也含有抑制细胞生长的成分，因此本研究中，参考既往文献的研究结果，当复合菌液浓度超过5%时，其抑制作用比较明显，选择＜5%的浓度来研究复合菌液对氧化损伤的PC12细胞的保护作用。

在本研究中，造模组细胞存活率显著低于阴性对照组，细胞LDH水平、NO含量显著高于阴性对照组。说明H2O2对PC12细胞具有损伤作用，能够降低细胞的存活率。LDH和NO能够反映细胞受损的情况。加入不同浓度的复合营养液组其细胞存活率显著升高，而LDH水平以及NO含量也显著下降，说明复合营养液对H2O2损伤的PC12细胞具有保护作用。另外，本研究还发现，伴随着复合营养液浓度的不断增加，相应的细胞的存活率也呈现出逐渐升高的趋势，而NO含量逐渐下降，说明其对氧化应激损伤的PC12细胞的保护作用具有一定的浓度依赖性。但是浓度为1%的复合营养液组LDH水平最低，而随着浓度增加，LDH水平也逐渐增加，这可能是因为随着复合营养液浓度的增加，会对细胞产生一定的损害作用，从而导致部分细胞发生LDH渗漏。虫草具有抗氧化应激的作用，冬虫夏草对超氧阴离子自由基和羟自由基具有清除作用。具有抗脂质过氧化的作用，对体外细胞的氧化应激损伤具有保护作用。付健阳等［14］研究发现，虫草通过改善机体微循环及氧化应激水平，调节血脂水平等对1型糖尿病大鼠肾脏发挥保护作用。李风华等［15］研究发现，虫草菌丝能够显著大鼠肝纤维化模型大鼠超氧化物歧化酶（SOD）的活性，从而发挥抗氧化应激的作用。

综上所述，虫草复合营养液对体外PC12细胞的氧化应激具有保护作用，抑制LDH的渗漏，并降低上清中的NO水平，但是虫草复合液中既含有促进细胞生长成分，也含有抑制细胞生长的成分，因此要根据不同的目的，选择适合的浓度。

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（编校：吴茜）

Study on the protective effect of Cordyceps composite nutrient solution in hydrogen peroxide-induced PC12 cell injury

HAO Chun-yan

（Department of Nursing，First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China）

ObjectiveTo study the protective effect of Cordyceps composite nutrient solution on hydrogen peroxide-induced PC12 cell injury.MethodsP12 cellswere divided into negative control group，model group，low-dose group（1%Cordyceps complex nutrient solution），middle dose group（3%Cordyceps complex nutrient solution）and high-dose group（5%Cordyceps complex nutrient solution）.After 24 h cultured，except the negative control group，other groups were added H2O2and cultured for another 24h.Cell viability，LDH activity and NO were compared in each group.ResultsSurvival rate inmodel group was（62.8±4.2）%，the survival rate of the negative control group was（100.0±1.7）%，the survival rate in themodel group was significantly lower than that in negative control group（P＜0.01），and cell viability increased significantly in composite nutrient solution group compared withmodel group（P＜0.01）.Cellular LDH levels and NO content in themodel group and negative control group were significantly higher than that in negative control group（P＜0.01），which decreased significantly when added cordyclps composite nutrient solution（P＜0.01）.ConclusionCordyceps composite nutrient solution shows protective effect on hydrogen peroxide in PC12 cells.

Cordyceps；nutrient solution；H2O2；PC12 cells

R282.71

A

1005－1678（2014）04－0050－03

当氧化物的水平超过机体内源性抗氧化作用的时候，会导致分子氧化，组织损伤，此为氧化应激。脑组织中，脑神经元的膜结构由高浓度的不饱和脂肪酸组成，并且脑组织中的抗氧化酶水平较低，因此脑组织容易受到过氧化物的损伤。研究显示，氧化应激与帕金森病、老年痴呆等神经退行性疾病相关［1-2］。虫草具有抗氧化的作用，能改善体外细胞过氧化氢含量、过氧化氢酶活力等，虫草素还具有清除自由基的作用［3］。P12细胞和多巴胺神经元相似，来源于神经系统外胚层。本文对虫草复合营养液损伤在过氧化氢致P12细胞中的作用进行了探讨。

辽宁省科技厅课题（201101575）

郝春艳，女，硕士，教授、主任护师、硕士研究生导师，研究方向：临床护理、护理管理，E-mail：21127026＠qq.com。