调气行水合剂对肝癌腹水小鼠模型细胞凋亡基因的影响

杨志新，尤建良，浦琼华

（无锡市中医医院 肿瘤科，江苏 无锡 241071）

调气行水合剂对肝癌腹水小鼠模型细胞凋亡基因的影响

杨志新，尤建良Δ，浦琼华

（无锡市中医医院 肿瘤科，江苏 无锡 241071）

目的研究调气行水合剂结合顺铂、白介素-2腹腔注射对肝癌腹水小鼠模型细胞凋亡基因Bax、Caspase-3、TGF-β1蛋白表达的影响，从分子生物学水平揭示其治疗肝癌腹水的机制。方法将72只纯系昆明小鼠随机分为对照组、纯中药组、中西医结合大、中、小剂量组及西药组，每组12只。用药结束后，处死小鼠，应用免疫组化法检测小鼠肝肿瘤组织Bax、Caspase-3、TGF-β1蛋白表达情况。结果通过图像分析系统对免疫组化图像面积及积分光密度进行测算，中西医结合大剂量组细胞凋亡基因Bax蛋白的阳性表达率显著高于对照组（P＜0.01）。中西医结合大、中剂量组细胞凋亡基因Caspase-3、TGF-β1蛋白的阳性表达率显著高于对照组（P＜0.01）。结论中西医结合大剂量组可明显增加细胞凋亡基因Bax蛋白表达，中西医结合大、中剂量组可明显增加细胞凋亡基因Caspase-3、TGF-β1蛋白表达，诱导细胞凋亡。揭示了调气行水合剂联合顺铂、白介素-2腹腔注射治疗肝癌腹水的作用机制。

肝癌腹水；调气行水合剂；Bax；Caspase-3；TGF-β1；细胞凋亡

调气行水合剂为经方小柴胡汤与五苓散合方化裁而来，为江苏省无锡市名中医尤建良所创，临床治疗肝癌腹水及肝硬化腹水疗效显著。现正在对该药进行进一步的临床及实验研究。临床应用该方联合顺铂、白介素-2治疗肝癌腹水取得良好效果［1］。本研究采用小鼠肝癌腹水模型，旨在评价调气行水合剂的疗效及其对肿瘤细胞凋亡的影响，以探讨其治疗恶性肿瘤的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 纯系昆明小鼠72只，雌雄各半，4～6周龄，购自上海实验动物中心，动物许可证号：SYXK（苏）2007-0003，给予正常饲料喂养。

1.1.2 药物及试剂 调气行水合剂（方药组成：柴胡10 g，姜半夏 10 g，党参 10 g，甘草 6 g，黄芩10 g，炒白术15 g，桂枝5 g，泽泻30 g，茯苓30 g，猪苓30 g，莪术15 g，泽兰30 g，生姜10 g等。按处方称取上述药材，加水浸泡0.5 h，煎煮2次，合并煎液，静置24 h，滤过，滤液浓缩至 300mL，含生药量 0.703 g／mL），顺铂针10mg／支（齐鲁制药有限公司，批号：3090241DB），白介素-2注射液50万单位／支（北京四环生物制药有限公司，批号：201103006）。0.9%氯化钠注射液500 mL／袋（江苏亚邦生缘药业有限公司，批号：110308009）。

Caspase-3，bax一抗（scbt公司）；TGF-β1一抗（epitomics公司）；SABC免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；小鼠H22肝癌细胞株（江南大学动物实验中心）。

1.1.3 仪器设备 数显恒温水浴箱HH.W21-Cr600（北京长源实验设备厂）；电子天平AL104（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；TD5A-WS台式离心机（长沙湘仪离心仪器有限公司）；Galanz机械不锈钢烧烤微波炉WD7505（珠海飞龙电器有限公司）；容声电冰箱BCD-201／HC（广东科龙电器公司）；湿盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；LEICA 2135切片机（上海莱卡公司）；漂烘片机YABO 200（常州市雅博电子设备有限公司）；病理组织包埋冷冻台BMJ-Ⅲ型（常州中威电子仪器厂）；电热恒温培养箱DNP-9162（上海跃进医用光学仪器厂）；电热恒温培养箱WMK-02（南京医用仪器厂）；Olypums BX51显微镜（奥林巴斯中国有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模与分组 复苏小鼠H22肝癌细胞株，从液氮罐快速取出装有冰存细胞的冰存小管，将冰存小管快速放于40℃水浴摇床中以60 r／min的速度慢摇至其溶解，溶解后马上转入37℃水浴箱，手工慢摇2min，离心弃上清，用生理盐水将细胞密度调至2×1010／L。小鼠腹部用75%酒精消毒，每只腹腔注射0.2mL（约含瘤细胞4×106）。共接种72只昆明小鼠。随机分成空白对照组、纯中药组、中西药小剂量组、中西药中剂量组、中西药大剂量组、西药组（每组12只昆明小鼠，雌雄各半）。第5天形成腹水后造模成功。

1.2.2 动物给药 实验时依据陈奇主编《中药药理实验方法》［2］推荐的实验动物与人用药量换算方法，即：小白鼠的日服药量＝人的日服药量×小白鼠与人的体表比（0.0026），对实验中小鼠用药剂量进行推算。调气行水合剂配成1.463mg／mL水溶液备用，顺铂配成0.156mg／mL，白介素-2配成2600μg／mL水溶液备用。造模成功后开始治疗。空白对照组每日生理盐水1mL灌胃，西药组放空小鼠腹水后腹腔内注射顺铂1 mL，白介素-21mL，每周1次。纯中药组调气行水合剂灌胃给药，每天2次，每只每次0.2mL。中西医结合治疗组在腹腔注射顺铂、白介素的基础上同时调气行水合剂灌胃给药每天2次，共15 d。小剂量组每只每次0.2m L；中剂量组0.5mL，大剂量组1mL。

1.2.3 标本采集和处理 末次给药后第二天，将小白鼠断颈处死，剥离瘤体。瘤体用多聚甲醛固定，用作石蜡切片及免疫组化。

石蜡切片制作步骤：①取材：组织厚度约2～3 mm，大小1.5 cm×1.5 cm×（0.2～0.3）cm；②固定：组织取下后应立即放入10%福尔马林（相当于4%甲醛）固定；③漂洗：流水冲洗2～10 h；④脱水：从低浓度酒精到高浓度酒精，70%（数分钟）→80%（60～120min）→90%（60～120min）→95%（60～120min）→95%（60～120min）→100%（60～120 min）→100%（60～120min）；⑤透明：二甲苯浸泡30min；⑥浸蜡：3～4 h；⑦包埋：先将熔化的石蜡倒入包埋框再用加热的镊子将组织块放入，包埋面必须平整，包埋后待石蜡稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固；⑧切片：修块→切片→展片→捞片→烤片。

免疫组化操作步骤：①石蜡切片脱蜡；②30%H2O2室温孵育30min，以消除内源性过氧化物酶的活性；③蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，重复2次；④5%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清。滴加一抗工作液（稀释倍数1∶1 000），4℃过夜；⑤PBS冲洗5min，重复3次；⑥滴加二抗工作液（稀释倍数1∶2000），37℃孵育30min；⑦PBS冲洗5min，重复3次；⑧滴加SABC试剂，37℃放置30min；PBS（pH7.2～pH7.6）冲洗5min，重复4次；⑨PBS冲洗5 min分钟，重复3次；⑩滴加DAB显色液，5min，直至显棕色为止；○11苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.2.4 镜检分析 200倍光镜下，选取每张切片中caspase-3，TGF-β，Bax着色最明显的10个视野，以捷达801D形态学图像分析系统采集图像并半定量检测染色阳性物质的面积和积分光密度，求其每视野的平均值，表示以上2种物质的含量。图像采集分析方法采用数码显微镜捕捉免疫组化图片（jpg格式）：启动捷达801D形态学图像分析系统进行免疫组化图片分析。

1.2.5 统计学方法 组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 各组bax蛋白表达情况 中西医结合大剂量组bax蛋白表达明显增加，与空白对照组比较有极显著差异。与西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。纯中药组及中西医结合中、小剂量组与对照组及西药组无明显差异（见表1、图1）。

表1 各组bax蛋白染色阳性物质的面积和积分光密度Tab.1 The image area and integral optical density of bax expression protein in every group

图1 各组bax蛋白染色结果（×200）Fig.1 Staining results of bax protein（×200）

2.2 Caspase-3蛋白表达 中西医结合中、大剂量组及西医组Caspase-3蛋白染色阳性物质及积分光密度与对照组差异极显著，中西医结合大剂量组与西医组比较差异显著（见表 2、图2）。

表2 各组Caspase-3蛋白染色结果Tab.2 the image area and integral optical density of Caspase-3 expression protein in every group

图2 各组Caspase-3染色结果（×200）Fig.2 Staining results of Caspase-3 in different groups（×200）

2.3 各组TGF-β1蛋白表达情况 The expression of TGF-β1

中西医结合中、大剂量组TGF-β1蛋白染色阳性物质及积分光密度与对照组差异极显著，中西医结合大剂量组与西医组比较差异极显著（见表3，图3）。

表3 各组TGF-β1蛋白染色阳性物质的面积和积分光密度Tab.3 the image area and integral optical density of TGF-β1 expression protein in every group

图3 各组TGF-β1染色结果（×200）Fig.3 Staining results of TGF-β1 in different groups（×200）

3 讨论

细胞的增殖、分化和凋亡相互协调，维持正常组织的生长平衡。如果打破这种平衡，凋亡受抑，增殖增强，细胞死亡率降低，而机体又不能重新恢复调节，则表现为生长的优势，最终形成肿瘤。有观点认为，肿瘤细胞可能起源于正常情况下本应该走向凋亡而未发生凋亡的细胞［3］。而肿瘤细胞群为了维持整体的高度增殖，会对癌细胞进行抗细胞凋亡的检验，保留那些能抗拒细胞凋亡而得以存活的细胞，并转为癌细胞。也就是说，肿瘤细胞的高增殖能力，一方面来自于肿瘤细胞的高增殖能力和低分化程度，另一方面来自于癌细胞的凋亡被抑制、生存延长。这在滤泡型B淋巴瘤中已得到证实［4］。调气行水合剂为经方小柴胡汤与五苓散合方加莪术、泽兰，临床应用配合顺铂、白介素-2腹腔灌注治疗肝癌腹水取得良好疗效［1］。据相关文献报道：日本的神代正道［5］对小柴胡汤的几种水溶性成分柴胡皂苷、人参皂苷、甘草甜素、黄芩皂苷和小柴胡汤的水溶性全部成分，分别处理体外培养的肝癌细胞株、胆管癌细胞株、正常大鼠肝细胞和正常人外周淋巴细胞。结果发现，各药效成分单独使用对2癌细胞株的凋亡诱导率很低，而小柴胡汤全成分作用最为明显。齐元富等［6］运用三棱和莪术来治疗各期肿瘤患者，发现其可以增强机体免疫力，改善血液循环，抑制并杀灭癌细胞，缓解病情等。机制可能是莪术提取物榄香烯能阻滞HL260细胞从S期进入G2期及M期，诱发细胞凋亡［7］。莪术醇对鼻咽癌细胞具有较明显的抗肿瘤作用，其发挥抗肿瘤作用在于抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡［8］。为进一步了解该方法的作用机理，我们采用小鼠H22肝癌细胞株腹腔内注射形成小鼠肝癌腹水模型，进一步评价其疗效及其对肿瘤细胞凋亡基因的影响。本实验研究结果显示，调气行水合剂纯中药组及中西医结合中小剂量组与空白对照组比较bax蛋白表达未见增加，中西医结合大剂量组bax蛋白表达明显增加，与空白对照组比较有极显著差异（P＜0.01）。与西药组比较差异显著。当细胞受到药物作用发生DNA损伤时，会诱导下游蛋白Bax等的表达，启动细胞程序性死亡过程，引起细胞凋亡［9］。故bax蛋白表达的增加明确提示了细胞凋亡的增加。

Caspase-3被称为“死亡蛋白酶”。正常情况下。胞质中的Caspase-3以无活性的酶原形式存在，细胞凋亡信号的出现可导致Caspase-3在多种蛋白水解酶的作用下发生裂解而活化，从而引发凋亡［10］。本研究显示中西医结合中大剂量组Caspase-3蛋白表达明显增加，与空白对照组比较有极显著意义（P＜0.01）。与西药组比较差异极显著（P＜0.01）。中西医结合中大剂量组均促进Caspase-3蛋白表达，促进细胞凋亡的发生。

研究发现TGF-β1可明显诱导原代培养的小鼠肝细胞发生凋亡［11］。TGF-β1诱导的肝细胞凋亡信号转导途径需要依赖Caspase-3和Caspase-8。TGF-β1诱导胃癌细胞BGC823细胞的凋亡。TGF-β1通过激活caspase-9途径诱导胃癌细胞BGC823细胞凋亡［12］。本研究显示中西医结合中大剂量组TGF-β1蛋白表达明显增加，与空白对照组比较有极显著意义。中西医结合中大剂量组均增加Caspase-3蛋白表达，促进细胞凋亡的发生。以上结果显示大剂量组调气行水合剂联合顺铂、白介素-2腹腔注可明显增加细胞凋亡基因 Bax、caspase-3、TGF-β1的表达，诱导细胞凋亡，与对照组及西药组比较差异均有极显著意义及显著意义。中剂量组调气行水合剂联合顺铂、白介素-2腹腔注亦可明显增加细胞凋亡基因caspase-3、TGF-β1的表达。纯中药组及中西医结合小剂量组均未见细胞凋亡基因表达增加。可见诱导细胞凋亡是中西医结合治疗肝癌腹水的机理之一，并具有对中药的剂量依赖型。相关文献报道：吴荻等［13］消水汤治疗肝癌腹水的临床及实验研究有中药复方对肝癌腹水的临床观察。提示中药复方对肝癌腹水治疗有效，但实验研究仅对疗效进一步评价无作用机制研究。熊忠太等［14］调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔直径、面积、周长及密度的影响研究了复方中药对肝癌腹水模型腹膜淋巴管的影响。齐元富等［15］六神丸对H22肝癌腹水移植瘤PDGF与VEGF表达的影响及相关机制探讨。提示六神丸抗肿瘤血管生成的机理与其抑制PDGF与VEGF表达密切相关。中药复方成分复杂，起效常有多方面作用机制。可对调气行水合剂的作用机制对抗肿瘤血管生成方面作用，做进一步的研究。

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（编校：吴茜）

Effect of the Tiao qi xing shui Decoxction on Bax，Caspase-3，
TGF-β1 Gene expression in mouse w ith ascetes hepatoma

YANG Zhi-xin，YOU Jian-liangΔ，PU Qiong-hua

（Department of Oncology，TCM Hosipital ofWuxi City，Wuxi214001，China）

ObjectiveTo investgate the effectof Tiao qi xing shui decoction combined with peritoneal injection DDP and IL-2 on Bax，Caspase-3，TGF-β1 gene expression in mouse with ascetes hepatoma，and explore itsmechanism from molecular biology.Methods72 pure lines of Kunmingmice were random ly divided into control group，Chinesemedicine group，combination of traditional Chinese and Westernmedicine，in high，middle，low dose group and Westernmedicine group，each had 12.Allmiceswere killed after treatment，and the expression of Bax，Caspase-3，GF-β1 protein inmouse liver tumor tissues were detected by Immunohistochemical.ResultsImmunohistochemical results showed that，the positive expression of apoptosis gene Bax protein in high dose group of TCM and Western Medicine was higher than that of control group（P＜0.01），and the positive expression of apoptosis gene Caspase-3，TGF-β1 protein in high and middle dose group of TCM and Western Medicine were higher than that of control group（P＜0.01）.ConclusionThe high dose group of TCM and Western Medicine can significantly increase the expression of Bax protein，the high and middle dose guoup of TCM and Western Mdicine can significantly increase the expression of Caspase-3，TGF-β1 protein，induction apoptosis.

hepatoma ascites；Tiao qi xing shui decoction；Bax；Caspase-3；TGF-β1；program cell death

R273

A

1005－1678（2014）03－0064－04

医学科技发展基金无锡市医管中心科研项目（YGZ1010）

杨志新，男，研究生，副主任医师，研究方向：肿瘤临床研究，E-mail：zhixin_yang＠sina.com；尤建良，通信作者，男，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤临床研究，E-mail：yjl1104＠21cn.com。