M icroRNAs在胰腺癌早期诊断中的应用研究

陈培勤，范钰

（1.江苏大学 临床医学系，江苏 镇江 212000；2.镇江第一人民医院 肿廇科，江苏 镇江 212000）

M icroRNAs在胰腺癌早期诊断中的应用研究

陈培勤1，范钰2Δ

（1.江苏大学 临床医学系，江苏 镇江 212000；2.镇江第一人民医院 肿廇科，江苏 镇江 212000）

目的分析MicroRNAs在胰腺癌早期诊断中应用的临床价值。方法3种胰腺癌细胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1和正常胰腺细胞以及胰腺癌患者100例和正常志愿者100例血浆，采用Real-time PCR检测mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达量，并进行统计分析；分别取胰腺癌组织100例，正常胰腺胰腺组织100例，采用免疫组化从组织水平检测mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达量，并进行统计分析。结果Real-time PCR检测结果显示，与正常胰腺细胞相比较，PANC-1、PaCa-2、AsPC-1 3种胰腺癌细胞中mir-155、mir-196a的表达量均明显增高（P＜0.05）；与健康志愿者血浆相比，胰腺癌患者血浆中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达明显增高（P＜0.05）。免疫组化结果显示，胰腺癌组织中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达明显高于其在正常胰腺组织中的表达（P＜0.05）。结论胰腺癌细胞系和胰腺癌组织中均高表达mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b，说明其与胰腺癌的发生、发展有密切关系，这些特异性的MicroRNAs有望成为胰腺癌早期诊断的标记物，有极高的诊断价值和广阔的临床应用前景。

胰腺癌；microRNAs；RT-PCR；免疫组化；早期诊断

1 材料与方法

1.1 材料 胰腺癌细胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1以及正常胰腺细胞购自中科院上海细胞库。RT-PCR仪（美国Bio—Rad公司）。一抗抗MMP-2抗体、二抗羊抗兔抗体（美国Sigma公司），Trizol提取试剂、逆转录试剂盒（美国QIAGEN公司）。胰腺癌组织100例和正常胰腺组织100例。胰腺癌患者100例，健康志愿者100例，所有患者均充分了解此次研究的利弊，并签署知情同意书，愿意配合研究中的各项工作，本研究获得了医院伦理委员会批准。患者年龄20～73岁，平均（47.1±6.3）岁。胰腺癌患者和健康志愿者在年龄、性别构成比等基本资料方面差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测 将3种胰腺癌细胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1、正常胰腺细胞采用 Real-time PCR检测 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达量。mir-155引物序列，上游：5’-GTCCCAATGCTGTCT-3’，下 游：5’-GGAAGTTGCATGCAT-3’，mir-196a引 物 序列，上游：5’-GTGGAGTCGTCCCTGA-3’，下 游：5’-AATGCTGTCTGTGGA-3’，mir-181a引物序列，上游：5’-GCCAATGCTGTGTGA-3’，下游：5’-GAATGCTGTCTTGGA-3’，mir-181b引物序 列，上 游：5’-TCTGTGGAGTCAATG-3’，下 游：5’-GTCTGTGGATTTGCA-3’，内参引物序列，上游：5’-CTTAGTTGCATGCAG-3’，下游：5’-AATCGTGTATAAGTC-3’，所有引物均由捷瑞生物引物合成公司合成。将胰腺癌患者和健康志愿者抽取2 mL血液放入加抗凝剂的试管中，静置1 h后离心，取上清液即为血浆。Real-time PCR过程：①采用Trizol提取试剂提取细胞和血浆总RNA，并进行质量鉴定，紫外分光光度计法测量总RNA样品在260 nm和280 nm处的吸光度值，如果样品A260／A280值在1.8～2.0之间，表明RNA纯度较高，无蛋白质和DNA等污染，可进行后续实验。②将反转录得到的cDNA，进行荧光PCR扩增。扩增程序为95℃、15min，94℃、15S，55℃、30 S，72℃、30 S，共 40个循环。检测 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达量。

1.2.2 免疫组化检测 采用免疫组化法检测胰腺癌组织和正常胰腺组织中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达量。

具体步骤如下：①配置 PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol／L，KCl 12.7 mmol／L，Na2HPO44.3 mmol／L，KH2PO4 1.4mmol／L；配置 0.01 mol／L柠檬酸钠缓冲液（CB，pH6.0）：柠檬酸三钠3 g，柠檬酸0.4 g。②脱蜡和水化：脱蜡前应将组织切片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。先将组织切片至于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；随后在无水乙醇中浸泡5min；95%乙醇中浸泡5min，75%乙醇中浸泡5min；③抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片：mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b含量测定使用胰酶修复。具体过程为：滴加0.1%胰酶，37℃消化。

TIMP-1含量测定使用抗原热修复方式。具体过程为：微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织切片放入，断电，间隔5～10min，反复1～2次 2）免疫组化染色SP法脱蜡、水化PBS洗2～3次，每次5 min 3%H2O2（80%甲醇）滴加在组织切片上，室温静置10minPBS洗2～3次，每次5min。抗原修复PBS洗2～3次，每次5min滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体滴加I抗50 uL，4℃冰箱湿盒过夜4℃过夜后37℃烘箱中复温45 minPBS洗3次，每次5min滴加II抗50 uL，37℃1 h，II抗中可加入0.05%的tween-20 PBS洗3次，各5min，DAB显色5～10min，在显微镜下观察染色程度PBS或自来水冲洗10min，苏木精复染2 min，盐酸酒精分化，自来水冲洗10～15min脱水、透明、镜检、封片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 15.0处理数据，正态计量资料用“x±s”表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种胰腺癌细胞系以及正常胰腺细胞中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达结果 与正常胰腺细胞相比较，3种胰腺癌细胞系中mir-155以及mir-196a的表达均明显高于其在正常胰腺细胞中的表达，差异有统计学意义（P＜0.05），但3种胰腺癌细胞系中mir-181a、mir-181b的表达与正常胰腺癌细胞相比，无显著性差异（见表1）。

表1 PANC-1、PaCa-2、AsPC-1以及正常胰腺细胞中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达Tab.1 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in PANC-1，PaCa-2，AsPC-1 and normal pancreatic cells

2.2 胰腺癌患者与健康志愿者血浆中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达结果 RT-PCR结果显示：健康志愿者血浆中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达量均明显高于胰腺癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 胰腺癌患者与健康志愿者血浆中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达Tab.2 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in the plasma of pancreatic cancer patients and healthy volunteers

2.3 胰腺癌与正常胰腺组织中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达结果 免疫组化结果显示：胰腺癌组织中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达均明显高于其在正常胰腺细胞中的表达，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。正常胰腺组织中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b表达量很少，颜色呈淡兰色。胰腺癌组织中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b表达量增加，颜色较正常组织偏深（见图1）。

表3 胰腺癌组织与正常胰腺组织中mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b表达结果的比较Tab.3 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in pancreatic cancer tissues and normal pancreatic tissue

图1 胰腺癌组织与正常胰腺组织中mir-155、mir-196a、mir-181b表达Fig.1 The expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in pancreatic cancer tissues and normal pancreatic tissue

3 讨论

研究发现，某些microRNAs异常表达与肿瘤的发生、发展有密切联系［7-8］。与正常组织比较，胰腺癌组织中可见多种miRNA的表达紊乱［9-10］。因此有必要分析MicroRNAs在胰腺癌早期诊断中应用的临床价值。由结果也可以看出，无论是胰腺癌细胞系还是胰腺癌血浆以及胰腺癌组织，miR-155、miR-196a在胰腺癌细胞株和胰腺癌中均显著高表达。通过与正常胰腺细胞相比较，PANC-1、PaCa-2、AsPC-1 3种胰腺癌细胞中 mir-155、mir-196a的表达量均显著增高（P＜0.05）；但 3种细胞中 mir-181a、mir-181b的表达量与正常胰腺细胞无明显差别。与健康志愿者血浆相比较，胰腺癌患者血浆中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达均显著增高（P＜0.05）。日本学者采用ERCP的方法收集了术前胰腺导管腺癌以及慢性胰腺炎患者的胰液，并对miRNA-155的表达进行分析，发现这种miRNA在胰腺癌患者中的表达均高于慢性胰腺炎患者［11-12］。本实验通过免疫组化结果显示，胰腺癌组织中 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的表达显著高于其在正常胰腺组织中的表达（P＜0.05）。也有研究者同样证实了 mir-155、mir-196a、mir-181a、mir-181b的异常表达与胰腺癌之间的关系［13］。综上所述，大量的实验研究表明：特异性miRNA的异常表达与胰腺癌有密切的关系，一些miRNA在胰腺癌细胞、血浆以及组织中高表达，应值得广大研究者的注意，对早期胰腺癌的检出具有重要的意义。miRNA在胰腺癌中作为一种潜在的肿瘤标记志物，有极高的诊断价值和广阔的临床前景的。

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（编校：吴茜）

M icroRNAs in the early diagnosis of pancreatic cancer

CHEN Pei-qin1，FAN Yu2Δ

（1.Clinical Medicine，Department of Jiangsu University，Zhenjiang 212000，China；2.Department of Tumor，The First People’Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang 212000，China）

ObjectiveTo analyze the clinical value ofmicroRNAs applied in the early diagnosis of pancreatic cancer.MethodsThe expression of mir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in three pancreatic cancer cell lines PANC-1，PaCa-2，AsPC-1 pancreatic cancer，normal pancreatic cells and plasmas of 100 patientswith pancreatic cancer，100 normal volunteerswere detected by Real-time PCR，and the resultswere analyzed.The expression of mir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b in 100 pancreatic cancer tissues and 100 normal pancreatic tissueswere detected by immunohistochemical，and the resultswere analyzed.ResultsReal-timePCR test results showed that compared with normal pancreatic cells，mir-155，mir-196a expression in three pancreatic cancer cells PANC-1，PaCa-2，AsPC-1 were significantly increased（P＜0.05）.Compared with healthy volunteers，mir-155，mir-196a，mir-181a，mir-181b expression of plasma in pancreatic cancer patientswere significantly higher（P＜0.05）.Immunohistochemistry results showed thatmir-155，mir-196a mir-181a and mir-181b expression in pancreatic tissue were significantly higher than that in normal pancreatic tissue（P＜0.05）.ConclusionThe expression ofmir-155，mir-196a，mir-181a andmir-181b are high in pancreatic cancer tissues and pancreatic cancer cell lines，which are closely related to the development of pancreatic cancer.Those microRNAs are expected to be cancer markers for early diagnosis of，pancreatic cancer，have highly diagnostic value and broad clinical application.

pancreatic cancer；microRNAs；RT-PCR；immunohistochemistry；early diagnosis

R446.1

A

1005－1678（2014）03－0052－03

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，胰腺癌早期的症状不典型，与慢性胰腺炎症状类似，不易被检出［1］，一旦被检出胰腺癌大多为晚期，晚期胰腺癌患者的预后极差，因此及时检出胰腺癌，对提高患者的生活质量至关重要［2-4］。MicroRNAs是一种内源性的，短片段的非编码RNA，其长度约为17～22个核苷酸，它通过特异性识别靶基因3’端或5’端非翻译区并与之结合从而调控靶基因的表达［5-6］。本研究分别从细胞水平和组织水平，采用Real-time PCR和免疫组化技术检测3种胰腺癌细胞、胰腺癌患者血浆及组织中microRNAs的表达情况，旨在为早期胰腺癌的诊断提供依据。

江苏省卫生厅中青年扶持计划（JW-2010BNO.019）

陈培勤，男，硕士，主治医师，研究方向：急性肺损伤发病机制与防治；范钰，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：消化道肿瘤的基础与临床，E-mail：jsdxcpqin＠126.com。