安子合剂对抗心磷脂抗体阳性流产小鼠母胎界面ERK1／2信号通路的影响

丁超，陆启滨

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学附属江苏省中医院 妇科，江苏 南京 210029）

安子合剂对抗心磷脂抗体阳性流产小鼠母胎界面ERK1／2信号通路的影响

丁超1，陆启滨2Δ

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学附属江苏省中医院 妇科，江苏 南京 210029）

目的研究细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）1／2信号通路参与抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibodies，ACA）阳性流产的发病过程，从细胞增殖的角度阐明安子合剂对ERK1／2信号通路的影响。方法采用免疫组化方法检测ACA阳性流产模型组、空白对照组、安子合剂低／中／高剂量组和阿司匹林组小鼠母胎界面ERK1、ERK2磷酸化水平。结果JD801形态学统计分析结果显示安子合剂低剂量组ERK1平均光密度值（0.678±0.097）接近空白对照组的平均光密度值（0.727±0.047），差异无统计学意义；模型组、安子合剂中剂量组、高剂量组、阿司匹林组ERK1平均光密度值（0.434±0.066、0.613±0.041、0.487±0.061、0.551±0.056）均较空白对照组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。模型组、安子合剂低剂量组、中剂量组、高剂量组、阿司匹林组 ERK2平均光密度值（0.430±0.058、0.621±0.041、0.562±0.047、0.449±0.062、0.515±0.045）均较空白对照组（0.708±0.038）明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论安子合剂可以通过ERK信号转导通路提高细胞增殖的活性，改善胎盘功能，改变妊娠结局。

抗心磷脂抗体；细胞外信号调节蛋白激酶1／2；流产；母胎界面；安子合剂

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级BALB／c雌性、雄性小鼠各25只，8周龄，体质量（25±2）g，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK（苏）2009—0001。雌性小鼠随机分为模型组4只、空白对照组4只、安子合剂低剂量组5只、中剂量组5只、高剂量组4只、阿司匹林组3只。其中安子合剂低／中／高剂量分别相当于成人剂量的1倍、2倍、4倍。

1.2 实验试剂与仪器 p-ERK1抗体、p-ERK2抗体，由bioworlde公司提供；通用型二抗试剂盒（PV-6000）、DAB显色剂（ZLI-9018），由北京中杉提供。RM2135切片机（德国 Leica），YB-7B石蜡包埋机（湖北孝感亚光）。

1.3 实验用药 安子合剂（由江苏省中医院提供，苏药制字 Z04000568，产品批号：100419，250mL／瓶）主要成分为：川断、桑寄生、菟丝子、杜仲、太子参、白术、苎麻根、黄芩、丹参等。分别浓缩成安子合剂高、中、低剂量，相当于生药含量的7.54 g／m L、3.77 g／mL、1.885 g／mL。阿司匹林（石药集团欧意药业有限公司，国药准字H13023635）为肠溶片，取75mg溶于76.9 mL蒸馏水中，配成0.975mg／mL的溶液。

1.4 给药方法 模型组：妊娠第1天给予蒸馏水灌胃，0.1mL／10 g，1次／日，连续14 d；空白对照组：妊娠第1天给予蒸馏水灌胃，0.1mL／10 g，1次／日，连续14 d；安子合剂低剂量组：妊娠第1天给予浓缩后的小剂量安子合剂灌胃，37.7mg／（g·d），0.1mL／10 g，1次／日，连续14 d；安子合剂中剂量组：妊娠第1天给予浓缩后的中剂量安子合剂灌胃，75.4mg／（g·d），0.1mL／10 g，1次／日，连续14 d；安子合剂高剂量组：妊娠第1天给予浓缩后的大剂量安子合剂灌胃，150.8 mg／（g·d），0.1 mL／10 g，1次／日，连续14 d；阿司匹林组：妊娠第1天给予溶解后的阿司匹林灌胃，0.0195mg／（g·d），0.1mL／10 g，1次／日，连续 14 d。

1.5 实验方法 参照文献［8］，取人β2-GPⅠ溶于无菌PBS中，调整浓度为100 ug／0.25mL，模型组、安子合剂低／中／高剂量组、阿司匹林组第1天注射人β2GP-1溶液与CFA（1∶1比例）混合液50 uL，空白对照组注射生理盐水50 uL；第8天以IFA代替CFA加强免疫1次；至第18天各组雌性小鼠与雄性小鼠1∶1合笼，自合笼之日起，每天按8∶00和14∶00分别观察一次，以见到阴栓为妊娠第0天。在妊娠第15天上午8时处死各组孕鼠，取子宫、胎盘。取胎盘、子宫组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋用于常规组织病理切片及免疫组化检测ERK1和ERK2磷酸化水平。

1.5 实验步骤 HE染色；免疫组化：采用二步法免疫组化检测试剂：（①脱蜡、水化组织切片；②根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理；③3%H2O2去离子水孵育5min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗；④滴加一抗，室温或37℃孵育30～60min，PBS或TBS冲洗3次，每次2min；⑤滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，室温或37℃孵育10～20min，PBS或TBS冲洗3次，每次2min；⑥应用DAB溶液显色；⑦蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0分析数据，正态计量资料以（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组孕鼠ERK1磷酸化水平比较 安子合剂低剂量组ERK1磷酸化水平与空白对照组比较差异无统计学意义；与空白对照组相比，模型组、安子合剂中剂量组、高剂量组、阿司匹林组ERK1磷酸化水平均明显降低，比较差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，空白对照组、安子合剂低剂量组、中剂量组ERK1磷酸化水平明显提高，比较差异有统计学意义（P＜0.01）；阿司匹林组ERK1磷酸化水平高于模型组（P＜0.05）。模型组与安子合剂高剂量组比较差异无统计学意义（见表1、图1）。

表1 各组孕鼠ERK1磷酸化水平比较Tab.1 Comparision of ERK1 phosphorylation level in each group

2.2 各组孕鼠ERK2磷酸化水平比较 与空白对照组相比，模型组、安子合剂低剂量组、中剂量组、高剂量组、阿司匹林组ERK2磷酸化水平均明显降低，比较差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，空白对照组、安子合剂低剂量组、中剂量组ERK2磷酸化水平明显提高，比较差异有统计学意义（P＜0.01）；阿司匹林组ERK2磷酸化水平高于模型组（P＜0.05）。模型组与安子合剂高剂量组比较差异无统计学意义（见表2）。

表2 各组孕鼠ERK2磷酸化水平比较Tab.2 Comparision of ERK2 phosphorylation level in each group

2.3 各组小鼠子宫蜕膜和绒毛组织细胞胞浆中ERK1、ERK2磷酸化水平病理结果分析 各组小鼠子宫蜕膜和绒毛组织细胞胞浆中ERK1、ERK2磷酸化水平病理结果均显示为：模型组在子宫蜕膜和绒毛组织胞浆中基本无表达；安子合剂低剂量组：子宫蜕膜和绒毛组织胞浆中呈弥漫性中高度表达，见大量表达物呈棕褐色窜珠状，表达水平接近于空白对照组；空白对照组：子宫蜕膜和绒毛组织胞浆中呈弥漫性高度表达，表达物呈棕褐色窜珠状；安子合剂中剂量组：子宫蜕膜和绒毛组织胞浆中呈弥漫性中度表达，见大部分表达物呈棕褐色窜珠状，表达水平低于安子合剂低剂量组，高于模型组及安子合剂高剂量组、阿司匹林组；安子合剂高剂量组：子宫蜕膜和绒毛组织胞浆中呈分散性低度表达，见极少量表达物呈棕褐色窜珠状，或未见表达物；阿司匹林组：子宫蜕膜和绒毛组织胞浆中呈弥漫性低度表达，见少量表达物呈棕褐色窜珠状，表达水平高于模型组、安子合剂高剂量组（见图1、图2）。

图1 各组母胎界面ERK1磷酸化水平（×400）Fig.1 Comparision of ERK1 phosphorylation level in maternal-fetal interface of each group（×400）

图2 各组母胎界面ERK2磷酸化水平（×400）Fig.2 Comparision of Raf1 phosphorylation level in maternal-fetal interface of each group（×400）

3 讨论

中医认为，发生免疫性流产其基本的病机为机体脾肾两虚、胎元不固［9］。安子合剂其方中川断、菟丝子以及桑寄生有补肾养血、固摄安胎之作用；苎麻根则可止血安胎、清热凉血、滋阴益肾；黄芩可清心肝之火，同时宁心安神；运用黄芩配伍白术，为历代安胎之圣药，具有清热安胎之功；太子参与白术相配伍，则可健脾肾而安胎；当归、丹参养血和血，疏通机体脉络，调畅机体胞宫气血，从而养胎元［10-11］。以上诸药合用，可标本兼顾，发挥滋阴清热、益肾安胎之功效。本研究中，选用阿司匹林作为阳性药物，阿司匹林在临床上可用于治疗ACA阳性的一种抗凝药物，因此相当于中医当中的活血化瘀药物，可作为治标之剂［12］。

ERK1／2的过度活化能够促使细胞周期的递进和细胞增殖，在滋养细胞的增殖分化及侵袭过程中发挥重要作用［13-14］。大量研究证明，ERK1／2与细胞的增殖、分化和血小板生成密切相关［15-17］。只有磷酸化的 ERKl／2才具有活性，由于 ERKl／2活性的降低，导致细胞增殖活力降低，胎盘功能减退，血流灌注不行，引发血栓，胚胎着床后出现早期死亡，实验通过ACA对ERK1／2活性的影响，证明ACA可完全抑制滋养层细胞的增殖，安子合剂能有效上调中剂量组和阿司匹林组母胎界面上ERK1、ERK2的磷酸化水平，显著上调低剂量组母胎界面上ERK1、ERK2的磷酸化水平，也进一步从细胞增殖的角度说明安子合剂能够通过ERK信号通路这一转导途径提高滋养细胞增殖的活力，改善胎盘功能，改变妊娠结局。

经临床证实，安子合剂具有着显著的临床疗效［18］，而本研究证实安子合剂能够通过ERK信号通路从而改善胎盘功能以及妊娠结局，揭示安子合剂保胎作用的分子机制，从而为其临床治疗奠定基础。但是否还有其他作用机制仍然需要进一步研究证实，并且由于研究时间和经费的局限，本课题研究还存在许多不足之处，未能进行体外培养ACA阳性流产患者的绒毛滋养细胞，今后将继续完善实验内容，将整体实验与离体实验相结合，对ACA阳性妊娠丢失动物模型母胎界面上组织超微结构进一步研究。

［1］李薇.1，25-（OH）2D3的免疫调节特性及对相关疾病的作用［J］.中国生化药物杂志，2006，27（6）：386-388.

［2］方敏，董毅，张水娟，等.烯丙雌醇联合利托君治疗习惯性流产的临床疗效［J］.中国生化药物杂志，2012，33（5）：665-666.

［3］陆启滨.抗心磷脂抗体阳性先兆流产的病因病机探析［J］.中华中医药学刊，2008，26（6）：1127-1129.

［4］Pérez-PérezA，MaymóJ，Duenas JL，et al.Leptin prevents apoptosis of trophoblastic cells by activation of MAPK pathway［J］.Arch Biochem Biophys，2008，477：390-395.

［5］Xie KM，Hou XF，LiMQ.NME1 at the human maternal-fetal interface downregulates titin expression and invasiveness of trophoblast cells via MAPK pathway in early pregnancy［J］.Reproduction，2010，139（4）：799-808.

［6］王永清，李俊，杨孜.p38MAPK信号传导通路在人绒毛滋养层细胞EMMPRIN表达和体外侵袭中的作用［J］.中国优生与遗传杂志，2007，15（8）：19-22.

［7］Galabova-Kovacs G，Matzen D，Piazzolla D，etal.Essen-tial role ofB-Raf in ERK activation during extraembryon-ic development［J］.ProcNatlAcad SciUSA，2006，103：1325-1330.

［8］肖世金，赵爱民，鲍世民.补体过度激活与自身免疫型复发性流产的关系［J］.上海交通大学学报，2011，31（8）：1125-1127.

［9］季春红.安子合剂对免疫性流产患者T淋巴细胞亚群影响的临床研究［D］.南京中医药大学，2010.

［10］朱姝，陆启滨.抗心磷脂抗体导致妊娠丢失的免疫病理机制及安子合剂的干预作用［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：177-181.

［11］张恒.安子合剂对封闭抗体不足致复发性流产的临床研究［D］.南京中医药大学，2012.

［12］朱姝，陆启滨.安子合剂对ACA阳性先兆流产患者CD4＋CD25＋FOXP3＋Treg细胞免疫调节的影响［J］.四川中医，2012，30（7）：59-61.

［13］Sebolt-Leopold JS，Herrera R.Targeting the mitogen-activated protein kinase cascade to treat cancer［J］.Nat Rev Cancer，2004，4：937-947.

［14］Garcia，de Gunzburg，EycheneA，et al.Thrombopoietin-mediated sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in UT7-Mpl cells requires both Ras-Raf-1 and Rapl-B-Raf development pathways［J］.Mol Cell Biol，2010，21（8）：2659-2670.

［15］Rouyez MC，Boucheron C，Gisselbrecht S，et al.Control of thrombopoietin induced megakaryocytic differentiation by the mitogenactivated protein kinase pathway［J］.Mol Cell Biol，1997，17（9）：4991-5000.

［16］Rojnuckarin P，Drachman JG，Kaushansky K.Thrombopoietin-induced activation of themitogen-activated protein kinase（MAPK）pathway in normalmegakaryocytes：role in endomitosis［J］.Blood，1999，94（4）：1273-1282.

［17］Kanaan RA，Aldwaik M，I-Hanbali OA.The role of connective tissue growth factor in skeletal growth and development［J］.Med Sci Monit，2006，12（12）：277-281.

［18］陆启滨，任青玲.安子合剂治疗抗心磷脂抗体阳性致先兆流产191例临床研究［J］.中华临床医学杂志，2007，7（11）：25-27.

（编校：吴茜）

Impact of Anziheji against ERK1／2 signaling pathways on the maternal-fetal interface of ACA positive abortion in m ice

DING Chao1，LU Qi-bin2Δ
（1.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China；2.Chinese Medicine Hospital of Jiangsu Province，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the role of ERK1／2 signaling pathways on the process of ACA positive abortion and explore the effect of Anziheji on ERK1／2 signaling pathways from cell proliferation.MethodsLevels of ERK1／2 on maternal-fetal interface of every mice in ACA positive abortion model group，blank control group，Anziheji low，mediate，high dose group，aspirin group were detected by immunohistochemical.ResultsThe average optical density value of ERK1 in Anziheji low dose group（0.678±0.097）was close to normal group（0.727±0.047），therewas no significant difference between them.Compared with blank controlgroup，the ERK1 average optical density value inmodelgroup（0.434±0.066），Anzihejidose group（0.613±0.041），high dose group（0.487±0.061）and aspirin group（0.551±0.056）were significantly lower，and the differences were all statistically significant（P＜0.01）.Compared with blank control group（0.708±0.038），the ERK2 average optical density values inmodel group（0.430±0.058），Anziheji low dose group（0.621±0.041），mediate dose group（0.562±0.047），high dose group（0.449±0.062）and aspirin group（0.515±0.045）were significantly lower，and the differences were all statistically significant（P＜0.01）.ConclusionAnziheji can improve the activity of cell proliferation，improve the function of the placenta and change the outcome of pregnancy through ERK signal pathway.

anticardiolipin antibodies；ERK1／2；abortion；maternal-fetal interface；Anziheji

R711.59

A

1005-1678（2014）03-0040-04

反复自然流产在育龄夫妻中的发病率为2%～5%，发病原因较为复杂，主要涉及到内分泌、遗传、免疫、代谢、感染等多个方面，大概80%以上的反复自然流产（repeated spontaneous abortion，RSA）是由免疫因素造成的［1-2］，其中抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibodies，ACA）阳性流产占较高的比例。在研究免疫性先兆流产的过程中，陆启滨［3］根据ACA阳性流产“脾肾两虚，血热夹瘀”的病因病机创立了安子合剂，安子合剂能够明显提高细胞增殖活力，降低小鼠血清ACA滴度，对血管内皮细胞损伤具有良好的保护和修复作用，显著降低胚胎丢失率。研究发现细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路与早期妊娠滋养细胞的侵袭相关，调节包括滋养干细胞在内的细胞增殖、分化与凋亡等多种生物学功能［4-6］。ERK突变的胚胎外胚层及胎盘锥形成不良，胚胎着床后出现早期死亡，转入正常ERK基因可拯救突变小鼠胎盘的异常发育［7］，提示ERK对滋养细胞的功能及妊娠的正常维持至关重要。据此我们考虑ERK1／2信号传导通路可能参与了ACA阳性流产的发生发展过程，本实验旨在从细胞增殖的角度阐明安子合剂的作用机制。

江苏省中医药领军人才培养计划（CJ200910）

丁超，女，博士在读，研究方向：流产类疾病，E-mail：dc19860923＠163.com；陆启滨，通信作者，女，教授、博士生导师、主任医师，研究方向：妇科疾病，E-mail：wenwd＠nuaa.edu.cn。