内皮祖细胞移植前后兔肺动脉高压模型血浆血栓素A2和前列腺素I2的水平变化

杨志瑜，夏岳，戚国庆

（河北医科大学第一医院 心内科，河北 石家庄 050017）

内皮祖细胞移植前后兔肺动脉高压模型血浆血栓素A2和前列腺素I2的水平变化

杨志瑜，夏岳，戚国庆

（河北医科大学第一医院 心内科，河北 石家庄 050017）

目的探讨移植内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）后，野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导兔肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PHA）模型中血浆血栓素 A2（thromboxane A2，TXA2）、前列腺素 I2（prostaglandin I2，PGI2）水平的变化。方法建立野百合碱诱导兔肺动脉高压模型；体外分离诱导兔内皮祖细胞，并进行鉴定；将50只新西兰大白兔随机分为3组，正常对照组和模型组经尾静脉注射M199培养基，EPCs治疗组经尾静脉注射荧光标记的EPCs。3周后测定兔血浆血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）和6-酮-前列腺素1α（6-keto-prostagland in F1 alpha，6-keto-PGF1α）的含量，并计算2者的比值。结果与模型组相比，EPCs治疗组血浆中6-keto-PGFlα的含量显著增加，为（130.67±17.54）μmol／L；TXB2的含量显著降低，为（402.89±27.98）μmol／L；2组TXB2／6-keto-PGF1α的比值差异有统计学意义（P＜0.01）。结论移植内皮祖细胞可以降低由野百合碱诱导的肺动脉高压中TXA2的含量及增加PGI2的含量，从而逆转肺动脉高压的损伤。

内皮祖细胞；肺动脉高压；TXA2；PGI2

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级新西兰大白兔50只，雌雄各半，兔龄6个月左右，体质量为（2.5±0.5）kg，由河北医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。本实验符合国家实验动物管理条例，所有动物分笼饲养，标准饲料，自由饮水。

1.2 主要试剂和仪器 MI99培养基购自杭州四季青生物有限公司；淋巴细胞分离液购自北京经纬博恒生物公司；胎牛血清、荧光染料购自Sigma公司；兔抗人CD34抗体、兔抗人FLK-1抗体、兔抗人CD133单抗购自Santa Cruz公司；FITC标记的山羊抗兔购自北京东亚免疫技术研究所；血栓素B2（Thromboxane B2，TXB2）和6-keto-PGF1α放免试剂盒购自北京美科迪生物技术有限公司；DAPI荧光染料购自Sigma公司。

iMark酶标仪（BIO-RAD，美国）；ThermoForma CO2孵箱（Thermo Scientific，美国）；EPICS-XL流式细胞仪（Beekman-Coulte，美国）；olympus-lx7o倒置荧光显微镜（olympus，日本）；SSI-3000多普勒彩超（东莞市健威医疗器械有限公司，中国）。

1.3 兔肺动脉高压模型的建立和动物分组 50只新西兰大白兔适应性喂养1周，在同等饲养条件下，采用随机数表法将其分为3组，正常对照组16只，雌雄各半，腹腔注射与模型组相同剂量的溶剂混合物；MCT单纯诱导PAH模型组16只，雌雄各半，注射MCT溶液，给药剂量为60 mg／kg；EPCs移植治疗组18只，雌雄各半，造模方式与模型组相同。3组均注射1次。2周后，对各组行彩超鉴定。

1.4 兔内皮祖细胞（EPCs）的分离培养与鉴定 采用Ficoll密度梯度离心法获得单个核细胞［6-7］。将新西兰大白兔以10%水合氯醛麻醉后，仰卧位绑定在兔台上，直接心脏穿刺采血。抗凝管收集血液，缓慢摇动，加入等体积PBS。吸取淋巴细胞分离液5mL，放入15mL离心管。沿试管壁加入血液。4℃，2 000 r／min离心20min，离心后离心管中内容物分为3层，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层。小心吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。末次离心后，弃上清，用5mL含有20%胎牛血清的M199重悬细胞。洗去悬浮细胞，37℃，5%CO2继续培养到第7天，用0.25%的胰酶消化细胞后，用经过多聚赖氨酸处理的玻片进行爬片。

选取生长良好的原代细胞，细胞长满约一半时用4%的甲醛溶液固定，免疫组化染色鉴定内皮标记物CD31、CD34、Flk-1的表达。空白对照时除一抗用PBS代替外基本步骤同其他2组。

1.5 兔EPCs的体外标记和计数 培养第7天，在50μg／mL EPCs培养液中加入荧光染料DAPI，37℃培养箱孵育30min。经离心，弃上清，PBS反复冲洗细胞3次（每次2min），洗去多余的DAPI。荧光显微镜下观察荧光标记率。将标记好的细胞重悬于100 uLM199培养基中，并调整细胞浓度为5×106／mL，用于细胞移植。

1.6 兔EPCs的细胞移植 经彩超检查，PAH模型造模成功后，正常对照组及MCT诱导模型组动物经尾静脉连续注射100 uL的M199培养基，连续3 d；EPCs移植治疗组动物经尾静脉连续注入DAPI标记的EPCs，连续3 d，每次注入5×105个EPCs。3组动物在相同条件下，喂养3周后，腹主动脉收集血液进行相关指标的测定。

1.7 TXA2、PGI2的测定及TXA2／PGI2比值的计算 血浆中6-keto-PGFlα和TXB2浓度测定采用放射免疫法测定并计算比值，严格按照试剂盒说明书进行操作。由于TXA2和PGl2性质极不稳定，含量难以测定。但PGl2和TXA2的代谢产物6-keto-PGFlα和TXB2极其稳定，故目前多通过测定6-keto-PGFlα和TXB2的含量来反映血浆中PGI2和TXA2水平。

1.8 统计学方法 所得数据用SPSS软件进行分析，正态计量数据用“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，计量资料采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔子注射MCT溶液后，彩超检查结果 彩色多普勒结果显示：正常组的肺动脉内径远小于主动脉宽度，肺动脉高压模型组肺动脉主干内径大于主动脉宽度，说明肺动脉压力高，肺动脉扩张，肺动脉高压。肺动脉高压模型组可探测到三尖瓣返流，呈五彩加速血流，示肺动脉高压模型成功（见图1）。

图1 肺动脉彩色多普勒检测结果Fig.1 Pulmonary artery color Doppler test results

2.2 EPCs的形态学观察与荧光染料标记 在镜下观察刚分离出来的单个核淋巴细胞，细胞小呈圆形，随着培养时间的延长，细胞逐渐变大，呈条形或梭形细胞。7d后在诱导成熟的EPCs加入荧光染料DAPI 30min后，暗室观察，可见细胞核被染成蓝色荧光（见图2）。

图2 EPCs形态及荧光染料标记Fig.2 EPCsmorphology and fluorescent dye-labeled

2.2 内皮祖细胞的鉴定 每天观察内皮组细胞的生长状况，培养第二天时即有少数细胞贴壁，形态圆形，较均匀，核位于细胞中心处。第五天时，细胞贴壁数明显增多，细胞开始变形，呈梭形。第七天时，细胞梭形形状更加明显，贴壁完全。此时对细胞进行标志物免疫组化实验，荧光显微镜观察EPCs均强显示CD34＋、Flk-1＋、CD31＋等标记物（见图3）。

图3 内皮祖细胞免疫荧光鉴定结果（×400）Fig.3 EPCs immunofluorescence results（×400）

2.3 EPCs移植对血浆TXB2、6-keto-PGFlα的含量及其比值的影响 与空白对照组相比，MCT模型组血浆中6-keto-PGFlα的含量明显降低，TXB2的含量也明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；TXB2／6-keto-PGFlα的比值较空白对照组明显增大，差异有统计学意义（P＜0.01）。EPCs移植后，移植动物血浆中6-keto-PGFlα的含量显著增加，TXB2的水平显著降低，与MCT模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.01，见表1）。

表1 血浆中TXB2、6-keto-PGFlα的含量及其比值变化Tab.1 Changes of the content of TXB2，6-keto-PGFlαand its ratio in Plasma

3 讨论

MCT诱导动物PAH模型为经典模型［8］，该实验运用次造模方式2个星期后，经彩超检查，镜下可见，与正常对照组相比，模型组肺动脉主干内径均增宽，提示PHA形成，PHA模型造模成功。近年来国内外学者研究表明EPCs不但具有促进新生血管形成能力，还能分泌多种血管生长的因子［9-10］。血管内皮细胞通过释放前列环素（PGE2）、血栓素A2（TXA2）等细胞活性因子来调节肺血管的收缩和血管内血栓形成等。在PHA发生时，血管内皮细胞功能受到破坏，分泌的各种细胞因子之间的调节失衡，导致血管重塑，在PHA的后期治疗及疾病发展进展中起着重要作用［11-12］。研究表明静脉来源的EPCs注入到肺的细动脉及移植肾上腺素转导的EPCs可以很大程度的改善肺动脉高压［12］。

TXA2和PGI2是一对在PHA发病过程中起重要作用的血管收缩、舒张活性物质［13］。TXA2具有高效血小板聚集和促进血管收缩的能力，具有收缩肺动脉、促进肺内各级血管平滑肌细胞和纤维母细胞增生、增值的作用，但在体内极不稳定，发挥作用后，会迅速代谢转化为无活性的TXB2。肺血管收缩和肺小动脉内微血栓形成的主要原因就是由于PHA患者肺循环血浆及组织中TXA2含量明显升高。PGI2具有强大的扩血管和抗血小板凝集、释放功能。PGI2半衰期也很短，代谢后形成稳定的6-keto-PGF1α。PHA时，由于血管内皮受损、合成和分泌PGI2减少，血浆循环中PGI2含量呈降低趋势，导致血管收缩，血小板聚集形成血栓［13-15］。本实验中，采用MCT诱导PHA模型，血浆中TXB2的含量明显升高，与对照组相比，差异有统计学意义；血浆中6-keto-PGFlα的含量明显降低，与对照组比较，差异有统计学意义。通过体外诱导单个核细胞，诱导成EPCs，经尾静脉移植，可以逆转PHA模型血浆中TXB2的含量升高及血浆中6-keto-PGFlα的含量降低，降低 TXB2／6-keto-PGFlα的比值，与模型组相比，差异有统计学意义，显示EPCs缓解了MCT诱导的PHA模型中内皮细胞的损伤。

综上所述，PHA模型造模成功后，经过移植内皮祖细胞，能降低模型组血浆中TXB2的含量，升高血浆中6-keto-PGFlα的含量，TXB2／6-keto-PGFlα比值降低，从而保护了内皮细胞功能的紊乱，舒张血管，降低了血小板的聚集，减少血栓的形成，抑制肺动脉高压的进一步损伤。但EPCs移植能改善PH的肺动脉高压的状态，所有的实验现象目前只局限于动物，而每次外周血的采集能力有限，对于多次分离培养对治疗效果有没有效果仍然未知，关于其具体的作用机制，仍需进一步探究。

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（编校：吴茜）

The change of TXA2 and PGI2 in Rabbitmodel of pulmonary hypertension after progenitor cell transplantation

YANG Zhi-yu，XIA Yue，QIGuo-qing

（Department of Cardiology，The First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo discuss the changes of plasma TXA2 and PGI2 levels in the rabbitmodel of pulmonary hypertension（PHA）induced by monocrotaline（MCT）when transplanted with endothelial progenitor cells（EPCs）.MethodsThe rabbit pulmonary hypertensionmodelwas constructed by MCT induction.Rabbit endothelial progenitor cells were induced，separated and identified in vitro.50 New Zealand white rabbits were random ly divided into 3 groups，normal control group and model group were given M199 culturemedium by tail vein injection，EPCs treatment group were given EPCsmarked with fluorescent though tail vein injection.The levels of plasma TXB2 and 6-keto-PGF1αwere detected and their ratiowere calculated after three weeks.ResultsCompared with model group，the content of 6-keto-PGFlαin plasma in EPCs group was（130.67±17.54）umol／L，which was increased sinnificantly.The content of TXB2 was（402.89±27.98）u mol／L，which was decreased significantly.The ratio of TXB2 to 6-keto-PGF1 alpha between two groups was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionEPCs transplantation can reduce the content of TXA2 and increase the content of PGI2 in the pulmonary hypertension rabbits induced bymonocrotaline，then reverse the damage of pulmonary hypertension.

endothelial progenitor cells；pulmonary arterial hypertension；TXA2；PGI2

R453.9

A

1005－1678（2014）03－0031－04

肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）在肺部循环疾病中占据重要位置，是由多种因素如心、肺本身或全身性疾病引起的在临床中表现为肺动脉压进行性增高的一种疾病［1］。PAH的发病机制由多种因素共同参与，牵涉到多种生物学途径。目前，在PAH的临床治疗中，主要通过延缓患者临床症状的进展来控制疾病发展，从而达到延长患者寿命的目的。研究发现，血管内皮细胞在PAH的发展进程中，具有重要作用［2-3］。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一种前体细胞，能增殖并分化为血管内皮细胞，对维持正常内皮功能起重要作用，对PAH患者进行内皮祖细胞移植，在体内可募集、归巢到血管损伤区，促进血管损伤后内皮修复、减少内膜增生，纠正内皮功能从而改善肺动脉高压症状［4］。肺血管内皮细胞还可以分泌一些调节肺血管舒张度及血栓形成的各种活性物质如前列环素、血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）。前列腺素不但具有舒张血管及抗血小板聚集作用，而且还有抗增殖作用，TXA2具有强效血管收缩和血小板促凝作用，因此前列腺素和血栓A2代谢失调在PAH形成的过程中具有重要作用［5］。本试验拟运用野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导兔PAH模型，收集培养兔外周血单个核细胞，经诱导、分化为EPCs，经尾静脉注射进行移植手术。TXA2在体内极不稳定，会快速代谢为稳定的化合物TXB2；前列腺素I2（prostaglandin I2，PGI2）的半衰期也很短，但其代谢物6-酮-前列腺素1α（6-keto-prostaglandin F1 alpha，6-keto-PGF1α）却非常稳定。因此本实验中拟采用检测TXB2、6-keto-PGF1α的含量并计算TXB2／6-keto-PGF1α的比值来间接表征TXA2、PGI2的变化关系，以期更好的研究EPCs移植对PAH的影响。

杨志瑜，女，硕士，主治医师，研究方向：心血管疾病，E-mail：yangzhiyuhrz＠126.com。