ADAM 8基因调控AKT／m TOR通路对结肠癌细胞HCT8的影响

白杨，陈浩，李纪政，黄进团，杨祖立

（中山大学附属第六医院 胃肠外科，广东 广州 510655）

ADAM 8基因调控AKT／m TOR通路对结肠癌细胞HCT8的影响

白杨，陈浩，李纪政，黄进团，杨祖立Δ

（中山大学附属第六医院 胃肠外科，广东 广州 510655）

目的探讨解整合素样金属蛋白酶8（a disintegrin and metalloprotease domain 8，ADAM8）基因对结肠癌HCT8细胞增殖及增殖信号转导途径PI3K-Akt-mTOR的影响。方法体外培养结肠癌HCT8细胞，构建含ADAM8基因过表达质粒载体和ADAM8基因RNA干扰质粒载体；转染至HCT8细胞，分为过表达组、干扰组和对照组。采用EdU和MTS方法检测细胞增殖情况，PI3K酶活检测试剂盒检测细胞内PI3K酶活，Western Blot方法检测细胞内Akt、p-Akt相对表达量和mTOR的表达量。结果过表达组细胞增殖能力（1.22±0.13）显著高于对照组（1.00±0.12）（P＜0.05），干扰组细胞增殖能力（0.78±0.11）显著低于对照组（1.00±0.12）（P＜0.05）。与对照组相比，过表达组和干扰组细胞内PI3K的酶活变化差异无统计学意义。ADAM8过表达后细胞内p-Akt和mTOR表达量均增加，干扰表达后p-Akt和mTOR表达量均降低。结论ADAM8可通过增强Akt的磷酸化和mTOR的表达促进HCT8细胞增殖。

解整合素样金属蛋白酶8；结肠癌；免疫印迹；干扰表达

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及主要实验仪器 结直肠癌细胞株HCT8购自中科院上海生化细胞所细胞库。包含ADAM8序列的载体质粒购自吉凯基因公司（GOSE38134）。质粒小抽试剂盒购自biomiga（PD1212-01）。EdU检测试剂盒购自广州锐博生物。MTS（CellTiter 96 AQueous One Solution细胞增殖试剂盒）购自美国Promega公司。其他试剂（如转染试剂等）均购自 Life Technology。PI3-Kinase Activity AlphaScreen®Assay Kit（货号：K-1300）购自 echelon公司。主要抗体：mouse monoclonal anti-ADAM8 antibody（ab89127，abcam，UK），rabbit anti-p-Akt（＃4060；Cell signaling Technology），Akt（pan）（40D4）Mouse mAb（＃2920；Cell signaling Technology），mTOR（7C10）RabbitmAb（＃2983P；Cell signaling Technology），mouse anti-GAPDH （sc-32233；Santa Cruz Biotechnologies，USA）。

主要实验仪器：莱卡 DMI4000B智能型倒置荧光显微镜（Leica Micro-systems，Germany）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific，USA）；ABI 7500型实时荧光定量 PCR仪（Applied Biosystems，USA）；Odyssey双色红外荧光成像系统（LI-COR，USA）；DU-730紫外／可见分光光度计（BECKMAN，USA）；Eppendorf 5418小型高速离心机（Eppendorf，Germany）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，USA）；Forma SeriesⅡCO2培养箱（Thermo Fisher Scientific，USA）；ME103E／02型电子天平（METTLER TOLEDO，USA）。

1.2 载体构建 由上海吉凯基因化学技术有限公司完成ADAM8过表达载体和ADAM8 RNA干扰载体的构建和鉴定，命名为ADAM8 overexpression plasmid和ADAM8 RNAi plasmid。其中ADAM8 RNAi plasmid载体上携带的片段为 5’-TCACAGGGCTAGCAGTGTGGGT-3’，可 以 转 录 为 5’-UCACAGGGCUAGCAGUGUGGGU-3’（由吉凯基因公司提供），转录的RNA片段可以特异性地结合ADAM8。ADAM8 overexpression plasmid载体上携带有ADAM8 ORF片段，可以在细胞内表达ADAM8。

1.3 细胞培养 人结直肠癌细胞株HCT8常规培养于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养液中，于37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中，3～4d传代一次。取对数生长期细胞，按一定浓度接种培养用于实验。

1.4 分组和处理方法 将体外培养的HCT8细胞分成3组，分别为对照组、过表达组和干扰表达组。其中对照组转染空载质粒。过表达组则转染ADAM8 overexpression plasmid，干扰组转染 ADAM8 RNAi plasmid。按照 Lipofectamine®LTX＆Plus Reagent操作手册：使用150μL Opti-MEM培养基（FBS free）稀释5μL Lipofectamine LTX试剂，使用 150μL Opti-MEM培养基（FBS free）稀释3μg质粒DNA溶液 并加入5μLPlus试剂，然后将2种稀释液混合，并室温孵育5min，最后将上述混合液加入至六孔板中。每组设置3个复孔。于37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中，培养48 h时进行相应检测。

1.5 细胞增殖试验 细胞增殖能力检测使用EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）细胞增殖试剂盒，实验前 1d细胞按2×104cell／well铺96孔板，设ADAM8对照组、过表达组和干扰组，每组2个复孔，分别转染后于37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养48 h，取出96孔板，以1∶1000浓度进行EdU标记孵育2 h。细胞固定30min后依照说明书进行Apollo染色和DNA染色。荧光显微镜下观察。实验重复3次。MTS法用于细胞活性检测，实验前1天细胞按1×104cell／well铺96孔板，设ADAM8对照组、过表达组和干扰组，每组设5个复孔，转染后分别于0 h、24 h、48 h、72 h和 96 h取出 96孔板，加入 20 uL／well MTS溶液（单溶液细胞增殖检测试剂盒），37℃孵育1.5 h，在酶标仪上49 nm处读取OD值（A490）。实验重复3次。以时间和OD值绘制增值曲线。

1.6 PIP3K酶活检测 取出各组3个孔的细胞，0.05%胰酶消化细胞，PBS洗脱，900 r／min离心5min，去上清，收集细胞。使用 1×RIPA lysis Buffer（50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1%Nonidet P-40，0.5%deoxycholic acid，0.1%sodium dodecyl sulfate（SDS），5mM EDTA，2mM phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF），20 g／mL aprotinin，20 g／mL leupeptin，10 g／mL pepstanin A，150 mM benzamidine）提取细胞总蛋白，并用BCA法测定总蛋白的浓度，然后按照PI3-Kinase Activity AlphaScreen®Assay Kit说明书检测单位量的总蛋白中PI3K的活性。

1.7 Western Blot 用Western Blot检测细胞中ADAM8、Akt、Ser473 phospho-Akt和mTOR蛋白的表达。取相同数目的细胞，900 r／min离心5min，1×RIPA lysis Buffer重悬，冰上裂解30min。再经12000 r／min离心10min，收集上清液。用BCA方法定量蛋白浓度，并且按照每泳道10 ug的蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳。电泳（室温下80 V×20min，120 V×60min）结束后，转至PVDF膜（25 V／0.3A×45min，恒流），5%牛奶室温封闭1 h，一抗冰上孵育过夜，PBST清洗后使用IRDyes荧光共轭二抗标记的一抗，室温孵育1 h，在奥德赛红外成像系统上显影并分析各种蛋白相对于GAPDH的表达量。一抗mouse monoclonal anti-ADAM8 antibody（1∶250稀释），rabbit anti-p-Akt（1∶1 000稀释），Akt（pan）（40D4）MousemAb（1∶1 000稀释），mTOR（7C10）RabbitmAb（1∶1 000稀释），mouse anti-GAPDH（1∶10 000稀释）。

1.8 统计学方法 使用SPSS 13.0进行统计学分析。正态计量资料用“±s”表示，组间比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAM8过表达和干扰表达载体的构建 转染ADAM8过表达载体和干扰表达载体后检测HCT8细胞ADAM8表达量，由图1可知，过表达组ADAM8表达量显著高于对照组（P＜0.05），而干扰组ADAM8的表达量显著低于对照组（P＜0.05），说明过表达载体和干扰表达载体构建成功。

图1 转染ADAM8过表达和干扰表达载体后ADAM8表达情况a.Western Blot结果；b.蛋白表达辉度比例结果*P＜0.05，与对照组相比Fig.1 ADAM8 expression after transfected with ADAM8 overexpressionplasmid and RNA interference plasmida.Western Blot results；b.Protein luminance ratio results*P＜0.05，compared with control group

2.2 ADAM8过表达和干扰表达对细胞增殖的影响 采用EdU5-Ethynyl-2’-deoxyuridine方法检测ADAM8过表达和干扰后的细胞增殖情况见图2a，2b。从图中可以看出，过表达组细胞DNA复制活性（1.22±0.13）显著高于对照组（1.00±0.12，P＜0.05），干扰组细胞DNA复制活性（0.78±0.11）显著低于对照组（1.00±0.12，P＜0.05）。说明当ADAM8被干扰表达后细胞增殖能力下降，同时当ADAM8表达量上升后细胞增殖能力加强。采用MTS实验检测细胞活性，结果见图2c，结果同样说明干扰组细胞活性下降，而过表达组细胞活性增强。与EdU实验结果相符。

图2 转染ADAM8过表达和干扰表达载体后细胞增殖情况a，b.EdU检测细胞增值活性；c.MTS检测细胞增值活性*P＜0.05，与对照组相比Fig.2 Situation of HCT8 cell proliferation after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmida，b.Cell proliferation activity detected by EdU；c.Cell proliferation activity detected by MTS*P＜0.05，compared with control group

2.3 ADAM8过表达和干扰表达对PI3K-Akt-mTOR的影响为了验证过表达ADAM8和干扰表达ADAM8对细胞增殖信号转导的影响，本文对3组的PI3K酶活、p-Akt和Akt的相对量以及mTOR表达量进行了检测，结果见图3、4和5。从图3可看出，ADAM8过表达和干扰表达后细胞内PI3K的酶活性均未改变，说明ADAM8表达不会影响PI3K的酶活。图4可看出，ADAM8过表达后细胞内p-Akt表达量增加，被干扰表达后p-Akt表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。图5可看出，ADAM8过表达后细胞内mTOR表达量增加，被干扰表达后mTOR表达量降低。

图3 转染ADAM8过表达和干扰表达载体后HCT8细胞内PI3K酶活性变化情况Fig.3 PI3K activity in HCT8 cell after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmid

图4 转染ADAM8过表达和干扰表达载体后HCT8细胞内p-Akt相对于Akt表达量a.Western Blot结果；b.蛋白表达辉度比例结果*P＜0.05，与对照组相比Fig.4 The ratio of p-Akt to Akt in HCT8 cell after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmida.Western Blot results；b.Protein luminance ratio results*P＜0.05，Compared with control group

图5 转染ADAM8过表达和干扰表达载体后HCT8细胞内mTOR相对表达量a.Western Blot结果；b.蛋白表达辉度比例结果*P＜0.05，与对照组相比Fig.5 RelativemTOR expression in HCT8 cell after transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interference plasmida.Western Blot results；b.Protein luminance ratio results*P＜0.05，compared with control group

3 讨论

质粒转染细胞发挥的过表达作用可显著提高ADAM8的过表达效率，该技术作为新一代高效表达载体大大促进了肿瘤基因的基础研究。ADAM8在多数恶性肿瘤组织中丰富表达［5-7］，在结直肠肿瘤细胞中表达明显高于癌旁组织。但ADAM8在结肠癌细胞株HCT8细胞中表达相对较低（数据未发表），本文通过转染ADAM8过表达质粒和干扰质粒，比较过表达和抑制表达后细胞增殖情况，以及PI3K-Akt-mTOR细胞增殖信号转导中信号分子的表达变化。从结果可知，ADAM8过表达后细胞增殖增强，被干扰后细胞增殖减弱。可见ADAM8参与调控结肠癌细胞HCT8的增殖，可能是作为一种抑制癌细胞增殖的靶点分子。为进一步明确ADAM8参与HCT8细胞增殖的机制，对增殖信号转导途径PI3K-Akt-mTOR中的信号分子进行了研究。结果发现，ADAM8的表达变化不会影响细胞中PI3K的酶活，但过表达ADAM8会增强下游Akt的磷酸化，进而促进mTOR的表达。当ADAM8被抑制后情况正好相反。由此可见，ADAM8可通过增强Akt的磷酸化促进mTOR的表达，发挥对HCT8细胞的增殖促进作用。

与结肠癌发生相关的蛋白因子很多，如 CEA［8］、EGF［9］、Urotensin-II receptor［10］、CSF［11］等。Zhang Y等［12］在肝癌患者病灶组织中发现ADAM8过表达，且调查发现54.3%的肝癌患者病灶组织中ADAM8过表达，与Jiang C等［13］研究一致。Zhang W等［14］通过体外培养非小细胞癌细胞株，经ADAM8干扰后发现细胞对化药敏感性增强，且证实是通过STAT3信号途径发挥作用，进一步明确了ADAM8与癌症的相关性。有关ADAM8与结肠癌的相关性研究未见报道。本研究发现，利用质粒转染技术过表达ADAM8，能促进HCT8细胞的增殖，抑制表达后细胞增殖变缓，证实ADAM8基因参与了结肠癌细胞的增殖。

PI3K-Akt-mTOR信号转导途径是作为细胞增殖的主要调控信号通路［15-16］。本文也探讨了过表达和干扰表达ADAM8后细胞中上述信号分子的表达变化。PI3K作为一类生长因子受体效应分子，当生长因子受体与配体结合后会被激活。本文结果显示无论ADAM8过表达还是抑制表达，PI3K的活性均未改变，说明ADAM8不参与PI3K活化，可能在胞内发挥作用，或通过其他受体发挥影响细胞增殖的作用。值得注意的是，虽然PI3K无变化，但过表达ADAM8后，下游Akt的磷酸化水平显著增强，且mTOR表达量随之升高。抑制表达后作用相反。因此可以肯定的是，ADAM8是通过活化 PI3K-Akt-mTOR信号通路中 AktmTOR通路来发挥影响细胞增殖的作用。

本文初步探讨了ADAM8参与结肠癌细胞的增殖过程及相关机制，但ADAM8在实体瘤中的致癌作用及在相关肿瘤信号途径中的调控作用仍不明确，ADAM8对大肠癌中癌基因及抑癌基因的影响以及ADAM8在大肠癌细胞生长及耐药中的机制需要进一步探索。此外ADAM8对结直肠癌细胞转移能力的影响，包括迁移和侵袭等方面的作用和相关机制也将作为重要考察方向。这些都有待进一步研究。

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（编校：吴茜）

ADAM 8 gene promotes proliferation of colon cancer cell HCT8 through AKT／m TOR signaling pathway

BAIYang，CHEN Hao，LIJi-zheng，HUANG Jin-tuan，YANG Zu-liΔ

（Department of Gastrointestinal Surgery，The Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510655，China）

ObjectiveTo investigate the effectofa disintegrin and metalloprotease domain（ADAM8）gene on colon cancer HCT8 cell proliferation and proliferation signal transduction pathways PI3K-Akt-mTOR.MethodsColon cancer HCT8 cellswere cultured in vitro，and transfected with ADAM8 overexpression plasmid and RNA interfering plasmid.Cell proliferation were detected by EdU and MTSmethod assays.PI3K activity wasmeasured by PI3K activity detection kit，Western Blotmethod was performed to detect the ratio of Akt and p-Akt and expression ofmTOR.ResultsCompared with control group（1.00±0.12），the cell proliferation in ADAM8 overexpression group（1.22±0.13）was significantly higher（P＜0.05）and in RNA interfering group（0.78±0.11）was significantly lowerwhile PI3K activity had no significant changes in three groups.After ADAM8 overexpression，and the ratio of p-Akt／Akt and mTOR expression were increased significantly，while reduced significantly after RNA interferered.ConclusionADAM8 can promote HCT8 cell proliferation through enhancing the phosphorylation of Akt and promoting the expression ofmTOR.

a disintegrin and metalloprotease domain 8；colon carcinoma；immunoblotting；interference expression

R 735.34

A

1005－1678（2014）03－0024－04

结肠癌是肠道部位发生的恶性肿瘤，主要以腺癌为主。结肠癌上皮细胞的癌化、浸润和转移是结肠癌发生和恶化的特征［1］。在这个过程中，细胞增殖是影响结肠癌进展的主要因素。PI3K-Akt是细胞增殖和细胞凋亡中重要的信号转导途径，其中配体与受体的结合导致PI3K被激活，使PIP2磷酸化生成PIP3，然后导致Akt磷酸化，促进mTOR表达，从而促进细胞内转录因子表达，进而促进细胞增殖［2］。解整合素样金属蛋白酶 8（adisintegrin and metalloprotease domain 8，ADAM8）是由 ADAM8基因编码的蛋白，主要参与细胞与细胞间，细胞与基质之间相互作用，其在细胞黏附中发挥重要的作用［3］，与癌症细胞增殖相关［4］。近年来，国内外研究显示，ADAM8在不同肿瘤中的表达以及功能是不同的。临床研究发现ADAM8与肺癌［5］、乳腺腺［6］和前列腺癌［7］的发生和发展存在相关性。我们发现结肠癌患者病灶组织 ADAM8表达量会增加（数据未发表），因此猜测ADAM8的过表达可能与结肠癌相关。为了验证这一猜想，本文通过体外培养结肠癌细胞HCT8细胞，构建ADAM8过表达和干扰质粒载体，旨在观察ADAM8过表达和低表达后对细胞增殖及增殖信号转导途径PI3K-Akt-mTOR的影响。

白杨，男，硕士，研究方向：ADAM8基因的表达对结直肠癌细胞增殖及其他方面的影响，E-mail：Rexby1986＠163.com；杨祖立，通信作者，男，博士，副主任医师，研究方向：胃肠肿瘤研究，E-mail：yzlhlj7068＠163.com。