卡托普利预处理对急性心肌损伤大鼠细胞凋亡及g p1 3 0表达的影响

顾明，荆雪冰，车兆梅,刘同库,周艳

（1.北华大学 附属医院 心内科，吉林 吉林 132011；2.北华大学 基础医学院 组胚教研室，吉林 吉林 132013）

卡托普利预处理对急性心肌损伤大鼠细胞凋亡及g p1 3 0表达的影响

顾明1，荆雪冰1，车兆梅1,刘同库1,周艳2△

（1.北华大学 附属医院 心内科，吉林 吉林 132011；2.北华大学 基础医学院 组胚教研室，吉林 吉林 132013）

目的研究卡托普利预处理对急性心肌损伤大鼠心肌细胞凋亡及gp 130表达的影响及意义。方法将60只Wistar雄性大白鼠随机分为

3组：异丙肾上腺素损伤组、卡托普利预处理组、对照组（n=20）;用TUNEL方法检测心肌细胞凋亡;用免疫组化方法检测Bcl-2和Bax蛋白表达;用Western blot方法检测心肌组织gp 130表达。结果卡托普利预处理组与异丙肾上腺素损伤组比较，心肌细胞凋亡指数降低，Bax、gp 130表达减少，Bcl-2表达增加（P＜0.01或P＜0.05）。结论 卡托普利预处理可通过降低gp 130的表达来减少急性心肌损伤引起的细胞凋亡。

卡托普利;异丙肾上腺素;糖蛋白130;细胞凋亡

异丙肾上腺素（isoprenaline，Iso）可使大鼠体内儿茶酚胺浓度急剧增加，导致心肌细胞缺血缺氧，引起心肌损伤，故常用于制备缺血性心肌损伤的动物模型。心肌缺血预适应是指反复短暂的心肌缺血对心肌产生保护作用，使心肌对更长时间缺血的耐受性增强。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）可通过缺血预适应减轻心肌损伤，卡托普利（captopril，Cap）是第一代ACEI，在临床上广泛应用。糖蛋白130（glycoprotein 130，gp 130）是一种酪氨酸蛋白激酶受体，可被多种细胞因子激活。本实验通过给大鼠腹腔注射异丙肾上腺素，建立急性心肌损伤的动物模型，探讨卡托普利的心肌保护作用是否与心肌细胞凋亡及gp 130有关，为临床上使用ACEI延缓心室重塑提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 卡托普利粉剂（批号：0109017）购自常州制药厂；Iso（批号：018 k 5003）购自美国Sigma公司；gp 130兔多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国Roche公司；Bcl-2兔多克隆抗体及Bax兔多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验动物分组及给药 于哈尔滨医科大学动物中心购买健康的雄性Wistar大鼠60只，体质量（180±15）g，所有大鼠均给予普通饲料和水适应性喂养一周后随机分为3组，分别为对照组，异丙肾上腺素损伤组和卡托普利预处理组；每组20只。对照组：大鼠腹腔内注射生理盐水5.0 mg/(kg·d)连续3 d；异丙肾上腺素损伤组：大鼠腹腔内注射Iso 5.0 mg/(kg·d)，连续3 d；卡托普利预处理组：大鼠腹腔内注射Iso 5.0 mg/(kg·d)，连续3天。卡托普利预处理组注射前一天给予卡托普利100 mg/(kg·d)灌胃，连续4 d；异丙肾上腺素损伤组和对照组均在注射前一天给予生理盐水3 mL灌胃，连续4 d。末次注药1 d后处死大鼠、取材。

1.3 观测指标及实验方法

1.3.1 采用TUNEL方法检测心肌细胞的凋亡情况 将大鼠拉颈处死后取出心脏，从右室游离壁正中按心脏长轴方向切开，制作心肌组织石蜡切片；经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，加入蛋白酶K消化细胞膜，灭活内源性酶后加入TUNEL反应液；PBS冲洗，苏木素复染及正丁醇脱水。在光学显微镜下，凋亡的心肌细胞核被染成棕褐色，为阳性；正常的心肌细胞核可被染成蓝色。在每张切片中随机选取5个无重叠的视野，计数每个视野里心肌细胞总数及凋亡心肌细胞数，按照如下公式计算心肌细胞凋亡指数，凋亡指数=(凋亡的心肌细胞数/心肌细胞总数)×100%。

1.3.2 采用免疫组化方法检测心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达 将石蜡切片脱蜡，使用乙醇脱水，灭活内源性过氧化物酶，采用抗原修复液抗原修复，使用PBS冲洗，先后加入一抗、二抗及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，滴加DAB显色剂，在光学显微镜下观察，若心肌细胞胞浆中出现棕黄色染色则为阳性。在每张切片中随机选取5个无重叠的视野，计算出阳性表达的心肌细胞总面积和视野心肌细胞总面积，阳性表达率=阳性表达的心肌细胞总面积/视野心肌细胞总面积×100%。

1.3.3 用Western blot方法检测心肌组织gp 130表达提取总蛋白质后用BCA法测定样品的蛋白浓度；用聚丙烯酰胺凝胶电泳；再将蛋白印迹到PVDF膜上；按实验步骤先后加入一抗、二抗的封闭液；最后加入显色液。在数字成像仪上成像，并对条带进行密度扫描。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学分析软件对本文数据进行处理。本文实验数据为计量资料，首先对数据进行正态分布性检验，对于符合正态分布性计量数据以“x±s”表示，多个样本均数之间差异性检验采用方差分析，而两组样本均数之间的比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞凋亡检测 心肌凋亡细胞染色强度可以根据显色浓淡及颗粒多少分为-～+++。凋亡细胞表现为+～+++。对照组大鼠心肌组织内仅偶见凋亡细胞；异丙肾上腺素损伤组和卡托普利预处理组大鼠心肌组织内均可见到大量的凋亡细胞。与对照组比较，异丙肾上腺素损伤组和卡托普利预处理组大鼠心肌细胞凋亡指数显著增高（P＜0.01），但卡托普利预处理组与异丙肾上腺素损伤组比较，心肌细胞凋亡指数显著减少（P＜0.01，见表1）。

表1 大鼠心肌凋亡指数、凋亡基因及心肌gp 130表达（n=20）Fig. 1 Myocardial cells apoptosis index, apoptosis gene and the expression of gp 130 protein (n=20)

2.2 Bcl-2和Bax蛋白表达 3组标本的胞浆中均有Bcl-2和Bax的表达，但强度不一，且多分布于心外膜下，符合心肌细胞凋亡的发生部位。表1显示：异丙肾上腺素损伤组与对照组比较，Bcl-2的表达明显降低，Bax蛋白的表达明显增加，组间比较有显著性差异（P＜0.01）；卡托普利预处理组与异丙肾上腺素损伤组比较，Bcl-2表达明显增高，Bax蛋白表达明显降低，组间比较有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）。

2.3 gp 130表达 3组大鼠心肌组织均能扩增出分子量为130 KD的蛋白表达条带。与对照组比较，异丙肾上腺素损伤组gp 130表达显著增高（P＜0.01）；与异丙肾上腺素损伤组比较，卡托普利预处理组gp 130表达水平明显降低，组间比较有显著性差异（P＜0.01，见表1）。

3 讨论

一个确切的动物模型的建立是动物实验成功的首要条件之一。1959年，Rona等[1]通过给大鼠皮下或腹腔内注射异丙肾上腺素，成功建立了大鼠心肌损伤的动物模型。异丙肾上腺素作用于心脏的β受体后，发挥正性的变力、变时、变传导作用，使心率加快、心室舒张期缩短，心肌收缩力增强，导致心肌耗氧量增加，造成心肌细胞的供氧与需氧不平衡，加重心肌缺血缺氧引起心肌组织损伤。本实验通过连续3次给大鼠腹腔内注射异丙肾上腺素5 mg/kg，成功复制了急性心肌损伤的大鼠动物模型，其病理特点与以往的报道相一致[2-4]组织、器官经过重复多次、短时间的缺血后，组织、器官不仅不会发生累积性损伤，反而能减轻随后的长时间缺血引起的损伤，这种现象被称为缺血预适应（ischemic preconditioning，IP）。Dekker等[5-7]认为IP过程可以分为3个阶段：（1）短暂性缺血导致的内源性触发物的形成；（2）信号转导通路的活化；(3)终末效应物的形成，最后诱导细胞损伤的延迟。研究人员根据IP的机制，人为的使用药物引起多次短暂而可逆的缺血，能够模拟或影响IP的不同环节，从而达到更有效地保护心脏的目的，这种做法被称为药理性预适应（pharmacologic preconditioning）。根据药理性预适应作用的不同环节，药理性预适应的方法有：(1)使用外源性触发物，如腺苷、缓激肽（bradykinin，BK）等；(2)调节内源性触发物，如血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）等。ACEI不仅可以抑制ACE，减少血管紧张素Ⅱ的生成，还可以抑制激肽酶使BK降解减少，导致内源性BK浓度的增加，从而拮抗内皮素及儿茶酚胺等心脏毒性物质，发挥保护心血管系统的作用。卡托普利作为第一代ACEI，目前仍在临床上广泛使用，并被用于制备IP动物模型。

Bcl-2的作用主要是通过抑制线粒体膜通透性转变孔的开放，使细胞色素C的释放减少，促使线粒体中的氢离子泵出，使线粒体的钙缓冲能力提高，从而阻止了Caspase-9凋亡途径的激活，抑制了细胞凋亡[8]。而Bax的作用主要是促进线粒体膜通透性转变孔的开放，使细胞色素C的释放增加，抑制氢离子从线粒体中泵出，促进细胞凋亡。与对照组比较，异丙肾上腺素损伤组gp 130蛋白的表达也升高，说明在使用异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤后，机体内gp 130的表达呈反应性升高。生理情况下，在心室肌细胞表达一定量的gp 130，具有调节细胞生长、增殖及分化的作用[9]。心肌损伤后，在去甲肾上腺素、血管紧张素Ⅱ及缺氧等因素的刺激下，可激活IL-6家族细胞因子如IL-6、CT-1、白血病抑制因子（LIF）等[10-12]，使下游gp 130的表达上调，被活化的gp 130从细胞浆向细胞膜转位，在细胞膜与细胞因子结合，激活Janus酪氨酸蛋白激酶（JAK）/信号转导和转录激活子（STAT 3）信号通路，当STAT3酪氨酸发生磷酸化后，引起核转位，与特定的DNA序列结合，导致介导心肌肥厚的基因被激活，引发心室重塑[13]。

有研究表明：缺血预适应可以减轻缺血再灌注引起的心功能不全，增强心肌收缩力，减少了心肌梗死面积及减轻心肌细胞凋亡；这一系列的保护作用可以被JAK抑制剂AG 490增加，说明缺血预适应或通过抑制JAK/STAT3通路诱发心肌存活通路，发挥心肌保护作用[14]。卡托普利通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活性，阻断血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的生成和作用。AngⅡ可增加促凋亡基因Bax蛋白的表达，降低抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达，从而下调使Bcl-2/Bax比值，诱导细胞凋亡[15-17]，所以卡托普利一方面通过拮抗AngⅡ发挥抑制细胞凋亡的作用；另一方面，卡托普利还通过拮抗血管紧张素Ⅱ介导的IL-6家族细胞因子（CT-1、LIF、IL-6）表达上调，间接抑制了其受体gpl 30的表达，从而抑制了JAK/STAT3信号通路，抑制介导心肌肥厚的相关基因，延缓心肌损伤后引起的心室重塑；此外，Tsuruda等[18-21]的研究报道，gp 130信号通路与内皮素受体（ETA）协同作用后，可增强体外犬成纤维细胞的促增殖作用，因此抑制gp 130表达还可通过减少成纤维细胞生成延缓心室重塑。但也有研究认为，活化的gp 130可从细胞浆转位于细胞膜，与细胞因子作用，通过p 42/p 44 MAPK途径抑制凋亡信号的传递，减少心肌细胞凋亡，起到心肌细胞的保护作用[22-23]。

[1] Rona G,Chappel CI,Balazs T,et al.An infarct-like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat[J].AMA Arch Pathol,1959,67(4)：443-455.

[2] Manikandan P,Sumitra M,Kumar DA,et al.Antioxidant potential of a novel tetrapeptide derivative in isoproterenol-induced myocardial necrosis in rats[J].Pha rmacology,2002,65(2)：103-109.

[3] 周丽华,邹宁,滕宗艳,等.Caspase-3在异丙基肾上腺素致大鼠急性心肌损伤中的作用及 bFGF的影响[J].中国地方病学杂志，2004,23(2)：126-128.

[4] 刘滨,李红莉,刘阳,等.大鼠急性心肌损伤E选择素和细胞因子的变化[J].中国地方病学杂志，2005,24(2)：158-160.

[5] Dekker LR.Toward the heart of ischemic preconditioning[J].Cardiovasc Res,1998，37(1)：14-20.

[6] 顾明,马鸿雁,李玉芹,等.卡托普利预处理对急性心肌损伤大鼠 CT-1 mRNA和 gp 130 mRNA表达的影响及意义[J].中国老年学杂志,2012,12(32)：2554-2556.

[7] 黄凌瑾,陈胜喜,罗万俊,等.卡托普利在开心手术中对心脏缺血延迟期的保护作用[J].湖南医科大学学报,2006,26(1)：73-76.

[8] 顾明,马鸿雁,李玉芹,等.卡托普利预处理对急性心肌损伤大鼠CT-1及凋亡相关基因表达的影响[J].中国地方病防治杂志,2011,26(3)：172-175.

[9] Heinrich PC,Behrmann I,Müller-Newen G,et al.Interleukin-6-type cytokine signalling through the gp 130/Jak/STAT pathway[J].Biochem J,1998（334）：297-314.

[10] Jougasaki M.Cardiotrophin-1 in cardiovascular regulation[J].Adv Clin Chem,2010（52）：41-76.

[11] Hishinuma S,Funamoto M,Fujio Y,et al.Hypoxic stress induces cardiotrophin-1 expression in cardiac myocytes[J].Biochem Biophys Res commun,1999,264(2)：436-440.

[12] Sano M,Fukuda K,Kodama H,et al.Interleukin-6 family of cytokines mediate angiotensin II-induced cardiac hypertrophy in rodent cardiomyocytes[J].J Biol Chem,2000,275(38)：29717-29723.

[13] Kunisada K,Negoro S,Tone E,et al.Signal transducer and activator of transcription 3 in the heart transduces not only a hypertrophic signal but a protective signal against doxorubicin-induced cardiomyopathy.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(1)：315-319.

[14] Hattori R,Maulik N,Otani H,et al.Role of STAT 3 in ischemic preconditioning[J]. J Mol Cell Cardiol,2001,33(11)：1929-1936.

[15] Monteiro P，Goncalves L, Providencia LA.Diabetes and cardiovascular disease： the road to cardioprotection[J].Heart,2005,91(12)：1621-1625.

[16] 周艳,李淑波,张媛,等.卡托普利预处理对大鼠急性心肌损伤的保护作用及其对心肌细胞凋亡的影响[J].吉林医学,2009,30(21)：2567-2569

[17] 熊先智,胡志伟,刘纬,等.血管紧张素Ⅱ诱导人内皮细胞凋亡[J].同济医科大学学报,2001,30(5)：434-436.

[18] Tsuruda T,Jougasaki M,Boerrigter G,et al.Cardiotrophin-1 stimulation of cardiac fibroblast growth：roles for glycoprotein 130/leukemia inhibitory factor receptor and the endothelin type A receptor[J].Circ Res,2002,90(2)：128-134.

[19] Freed DH,Chilton L,Li Y,et al.Role of myosin light chain kinase in cardiotrophin-1-induced cardiac myofibroblast cell migration[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301(2)：514-22.

[20] González A,López B,Ravassa S,et al.Cardiotrophin-1 in hypertensive heart disease[J].Endocrine,2012,42(1)：9-17.

[21] 余江恒,宋碧辉,李法琦.CT-1 mRNA和gp 130在高血压大鼠心肌中的表达变化及意义[J].基层医学论坛,2013,17(1)：18-20.

[22] Sano M,Fukuda K,Kodama H,et al.Interleukin-6 family of cytokines mediate angiotensin II-induced cardiac hypertrophy in rodent cardiomyocytes[J].J Biol Chem,2000,275(38)：29717-29723.

[23] Funamoto M,Hishinuma S,Fujio Y,et al.Isolation and characterization of the murine cardiotrophin-1 gene：expression and norepinephrine-induced transcriptional activation[J].J Mol Cell Cardiol,2000,32(7)：1275-1284.

Effect of apoptosis and gp 130 expression by Cap preconditioning on rats of acute myocardial injured

GU Ming1, JING Xue-bing1, CHE Zhao-mei1, LIU Tong-ku1, ZHOU Yan2△
(1.Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Beihua University, Jilin 132011, China；2 Department of Histology and Embryology, Medical College, Beihua University， Jilin 132013, China)

ObjectiveTo study the in fl uence of Captopril preconditioning on apoptosis and the expression of gp 130 in rats of acute myocardial injured。MethodWistar rats were randomly divided into three groups: control group, Iso group and Cap preconditioning group. Cardiomyocytes apoptosis was detected with TUNEL method. The expressions of Bcl-2 and Bax proteins in myocardium were tested by immunohistochemistry. The expression of gp 130 was tested with Western blot method。ResultsThe index of cardiomyocytes apoptosis was decreased, the expressions of Bax proteins and gp 130 were decreased and the expression of Bcl-2 proteins was increased in Cap preconditioning group compared with Iso group (P＜0.01 or P＜0.05)。ConclusionThe expression of gp 130 could be decreased through Cap preconditioning, which can reduce the cardiomyocytes apoptosis.

captopril; isoprenaline; glycoprotein 130; apoptosis

R 541.4

A

1005-1678(2014)01-0043-03

顾明，男，博士，主任医师，研究方向：缺血性心肌病的实验研究，E-mail:guming 71@163.com；周艳,通信作者，女，讲师，研究方向：缺血性心肌病的形态学研究，E-mail:zhouyan 74@aliyun.com。