转铁蛋白修饰共载阿霉素和R g 3脂质体靶向抑制胃癌细胞增殖

李华，胡世林，王海龙，朱志图△

（1.辽宁医学院附属第一医院 肿瘤科，辽宁 锦州121000；2.辽宁省北镇市人民医院 普外科，辽宁 北镇 121307；3.辽宁医学院附属第一医院 普外科，辽宁 锦州121000）

转铁蛋白修饰共载阿霉素和R g 3脂质体靶向抑制胃癌细胞增殖

李华1，胡世林2，王海龙3，朱志图1△

（1.辽宁医学院附属第一医院 肿瘤科，辽宁 锦州121000；2.辽宁省北镇市人民医院 普外科，辽宁 北镇 121307；3.辽宁医学院附属第一医院 普外科，辽宁 锦州121000）

目的制备转铁蛋白修饰共载细胞毒药物阿霉素(doxorubicin，DOX)和抗新生血管药物人参皂甙Rg3脂质体（TF modified doxorubicin and Rg 3 loaded liposome,TF-LP-DOX/Rg 3），研究与胃癌细胞的亲和力以及对胃癌细胞的增殖抑制作用。方法采用后插入法制备转铁蛋白修饰共载阿霉素和人参皂甙Rg3脂质体（TF-LP-DOX/Rg 3）。通过定量的细胞摄取实验和定性共聚焦实验研究胃癌细胞对普通脂质体（liposome,LP）和转铁蛋白修饰脂质体（TF modified liposome,TFLP）的亲和力。MTT实验研究不同载药脂质体对胃癌细胞的增殖抑制能力。构建MKN-28胃癌细胞肿瘤球模型，研究不同脂质体对肿瘤球的穿透能力和肿瘤球生长抑制作用。结果细胞摄取实验结果显示，MKN-28细胞对TF-LP的摄取效率是LP的2.9倍（P＜0.01）;MTT实验表明,TFLP-DOX/Rg3对MKN-28细胞的增殖抑制能力显著强于其他组(P＜0.01);肿瘤球实验结果显示，TF-LP-DOX/Rg3具有良好的肿瘤球穿透作用和肿瘤球生长抑制作用。结论转铁蛋白修饰共载细胞毒药物阿霉素(DOX)和抗新生血管药物人参皂甙Rg3脂质体是一种潜在高效的胃癌靶向给药系统。

转铁蛋白;阿霉素;人参皂甙Rg 3;肿瘤靶向

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，居于恶性肿瘤发病率的第3位[1]。在我国，胃癌的发病率居恶性肿瘤第2位，占恶性肿瘤死亡原因第3位[2]。目前，胃癌的治疗以手术为主，联合化疗为辅。然而，以细胞毒为主的化学治疗缺乏选择性，难免产生许多不良反应和毒性，病人耐受性较差。因此，具有肿瘤靶向性的药物干预载体成为了当前抗肿瘤研究的热点。转铁蛋白（transferrin，TF）受体是一种在正常细胞和肿瘤细胞表面都普遍存在的受体，但是其在肿瘤细胞的表面的表达是正常细胞的4～5倍[3-4]。本研究将转铁蛋白通过共价键连接到脂质体表面，共载细胞毒化疗药物阿霉素和抗新生血管药物Rg 3，对其胃癌细胞靶向性以及对胃癌细胞的抑制作用进行评价。

1 资料与方法

1.1 材料 大豆磷脂（SPC，美国Avanti polar lipids）；DSPE-PEG 2000（美国Avanti polar lipids）；胆固醇（美国sigma公司，批号：WQ 21938）； DSPE-PEG 2000-MAL (美国Avanti polar lipids，批号：AS 73628)；DMEM高糖培养基（美国赛默飞世尔科技公司）；阿霉素（浙江海正药业，批号：130812）；Rg3（美国sigma公司，批号：S137821）；胎牛血清（美国GIBCO公司）。胃癌细胞（MKN-28，ATCC)。

1.2 转铁蛋白修饰脂质体的制备及其表征 精密称取大豆磷脂12.50 mg，胆固醇1.06 mg，DSPE-PEG 20000.95 mg，Rg3 0.45 mg溶于氯仿中；在茄形瓶中减压蒸馏成膜，除去有机溶剂，置于真空干燥器中过夜；使其充分干燥，加入1 mL PBS水化，探头超声（80 W，超声10 s，间隔10 s，5次）得到载Rg3脂质体。采用硫酸铵梯度法[5-6]制备载阿霉素脂质体和共载阿霉素与Rg3脂质体。

采用后插入法[7-8]制备转铁蛋白修饰的共载阿霉素与Rg3脂质体。首先将转铁蛋白巯基化，再与商品化的DSPE-PEG 2000-MAL孵育得到转铁蛋白胶束，将胶束后插入已经制备的LP-DOX/Rg3得到TF-LP-DOX/Rg 3。取适量制备得到的脂质体样品，用激光粒度仪测定其粒径和电位。采用葡萄糖凝胶柱色谱法分离脂质体与未包载的阿霉素和Rg 3，将过柱后的脂质体采用triton-100破乳，用HPLC法在203 nm检测Rg3含量，在254 nm检测阿霉素含量。

1.3 细胞培养 将MKN-28细胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5%CO2，饱和湿度，温度为37℃。待细胞汇合度为0.8～0.9时，用2.5 mg/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.4 MKN-28 细胞对TF-LP的摄取 将对数生长期的细胞以5×105个/孔的密度接种于24孔板中，37℃培养24 h后，每孔加入适量TF-LP-DOX和LP-DOX使孔中阿霉素的浓度为0.20 nmol/mL，37℃分别孵育2 h和4 h后除去含脂质体培养基，冷PBS清洗3次，用流式细胞仪检测荧光读数。

为了定性观察MKN-28细胞对不同脂质体的摄取，将脂质体与细胞共同孵育4 h后，将细胞用PBS漂洗3次，加入2µg/mL DAPI溶液，室温孵育30 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦显微镜观察细胞摄取。

1.5 MTT 实验检测 TF-LP-DOX/Rg3对MKN-28细胞的增殖抑制作用 培养MKN-28细胞接种于96孔板中，107个/孔。当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入经无菌过滤的脂质体20µL，使每孔最终含阿霉素约0.25µg/mL和Rg311µg/mL。将孔板移入37℃、5%CO2孵箱中培养24 h和 48 h后取出，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20µL，继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入DMSO 200µL，37℃避光振摇15 min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的光密度值（optical density，OD），每组设3个复孔，计算细胞存活率。

1.6 肿瘤球的构建 取对数生长期的MKN-28细胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培养基中和胰酶，并将细胞吹打下来后离心，弃去上清液用培养基重悬细胞后接种于用低熔点琼脂糖预处理的96孔板中，将96孔板移入37℃CO2孵箱中培养。7天后成长为肿瘤球。

为了考察不同脂质体对肿瘤球的穿透能力，肿瘤球生长7天后，分别加入载阿霉素的TFLP和LP，加培养基调整脂质体的终浓度为120 nmol·mL-1。37℃孵育4 h后，将肿瘤球用PBS漂洗三次，加4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦显微镜观察肿瘤球摄取。

为了考察不同载药脂质体对肿瘤球生长的抑制作用，肿瘤球生长7 d后，加入TF-LP-DOX/Rg3、TF-LP-DOX、TF-LPRg3和LP-DOX/Rg3。以PBS为阴性对照组，统计肿瘤球体积大小变化。

1.7 统计学方法 正态计量数据以“x±s”表示：使用SPSS 21.0统计软件进行数据分析：2组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂质体的粒径、电位以及包封率 制备得到的各种脂质体的粒径均在130 nm左右，PDI小于0.3。阿霉素和Rg3的包封率分别为93.5%和82.2%(见表1)。

表1 脂质体的粒径，电位以及包封率（n=3）Tab.1 Characteristics of liposomes: particle size, size distribution, zeta-potential and entrapment ef fi ciency (n=3)

2.2 TF-LP-DOX的体外肿瘤细胞摄取实验 在MKN-28细胞表面转铁蛋白受体高度表达。细胞摄取的定量实验结果（表2）显示：脂质体与肿瘤细胞共孵育4 h后，MKN-28细胞对TF-LP-DOX摄取效率是普通脂质体的2.9倍，差异具有统计学意义（P＜0.01）。MKN-28细胞在4 h的摄取量是2 h的1.8倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）。定性的激光共聚焦荧光倒置显微镜观察结果如图1所示，TF-LP组荧光强度显著强于普通脂质体，这与定量的实验结果相一致。

表2 MKN-28细胞对不同脂质体的摄取效率（n=3）Tab.2 Uptake ef fi ciency of different liposomes by MKN-28 cells (n=3)

图1 激光共聚焦观察MKN-28细胞对载阿霉素脂质体的摄取(×1000).Fig.1 Uptake of doxorubicin loaded liposomes by MKN-28 cells based on confocal laser scanning microscopy(×1000)

2.3 TF-LP-DOX/Rg3抑制MKN-28细胞的增殖TF-LP-DOX/Rg3对胃癌细胞的增殖抑制率随着时间的延长而增长，TF-LP-DOX/Rg3在24 h对MKN-28细胞的抑制率是48 h的1.88倍（P＜0.01）；给药48 h后，TF-LP-DOX/Rg3对MKN-28细胞的抑制率是TF-LP-DOX、TF-LP-Rg3和LPDOX/Rg3的1.93倍、2.44倍和3.15倍（P＜0.01，见图2)。

图2 不同脂质体对MKN-28细胞的抑制率*P＜0.01，与24 h TF-LP-DOX/Rg 3 组相比；◇P＜0.01，与TF-LP-DOX、TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 组相比Fig.2 The inhibition rates of cells at various drugs at 24 h and 48 h after the treatment*P＜0.01，compared with TF-LP-DOX/Rg 3 group at 24 h；◇P＜0.01，compared with TF-LP-DOX，TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 group

2.4 TF-LP-DOX/Rg3的肿瘤球穿透性和肿瘤球生长抑制作用 肿瘤球穿透实验结果见图3，普通脂质体组红色荧光只在肿瘤球表面少量分布。经过转铁蛋白修饰后脂质体的阿霉素红色荧光在肿瘤球中均匀分布。

图3 载阿霉素脂质体对MKN-28肿瘤球的穿透实验(×1000)Fig.3 Uptake of doxorubicin loaded liposomes by MKN-28 tumor spheroids based on confocal laser scanning microscopy(×1000)

图4 给药7天后肿瘤球体积变化*P＜0.01， 与TF-LP-DOX、TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 组相比Fig.4 The change ratio of tumor spheroid after 7 days*P＜0.01， compared with TF-LP-DOX，TF-LP-Rg 3 and LP-DOX/Rg 3 groups

肿瘤球生长抑制试验结果所示（见图4），MKN-28胃癌细胞肿瘤球给药7 d后TF-LP-DOX、TF-LP-Rg 3、LP-DOX/ Rg3和TF-LP-DOX/Rg3分别使肿瘤体积减小到原体积的64%、79%、71%和45%，生理盐水组肿瘤球体积增大1.22倍，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

随着功能性纳米给药系统研究的发展，高选择性的高效药物传递系统为包括肿瘤等疾病的治疗带来了新的希望[9-11]。纳米给药系统能够包载水不溶性药物，降低细胞毒药物的毒副作用以及根据肿瘤特点进行表面修饰实现肿瘤主动靶向给药。Rg3是从人参中提取的一种单体成分。有研究证实：Rg3对包括肺癌[12]、肝癌[13]、结肠癌[14]和乳腺癌[15]等肿瘤疾病都有很好的疗效。本研究构建了转铁蛋白修饰共载阿霉素和人参皂苷Rg3的脂质体，并对其体内外靶向性和抗肿瘤活性进行评价。

本研究通过后插法制备的TF-LP-DOX/Rg 3，粒径在130 nm左右，得到了一个理想的纳米粒径。DOX和Rg3的包封率都在80%以上。双载药脂质体与阿霉素脂质体和Rg3脂质体的细胞毒性比较结果显示，阿霉素和Rg3共载药后能够显著增强对肿瘤细胞的增殖抑制能力。定性和定量的细胞摄取实验结果显示：经过转铁蛋白修饰后，胃癌MKN-28细胞对脂质体的摄取能力显著增强，这是由肿瘤细胞表面高度表达的转铁蛋白受体高效介导脂质体入胞。这与体外肿瘤细胞增殖抑制试验的结果相一致，说明共载药脂质体的细胞增殖抑制作用依赖于肿瘤细胞对脂质体的摄取。本研究构建了胃癌MKN-28细胞体外肿瘤球模型模拟脂质体的肿瘤球穿透能力和肿瘤球生长抑制作用，结果显示经过转铁蛋白修饰的共载阿霉素和Rg3脂质体能够高效穿透肿瘤球，且对肿瘤球的生长抑制作用显著强于其他脂质体。综上所述，本研究构建了转铁蛋白修饰的共载阿霉素和Rg3脂质体是一种潜在的胃癌靶向给药系统。其体内靶向性和体内抗胃癌作用正在研究中。

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TF modi fi ed doxorubicin and Rg3 loaded liposome for gastric cancer targeting and therapy

LI Hua1, HU Shi-lin2, WANG Hai-long3, ZHU Zhi-tu1△
（1. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000,China; 2. Department of General surgery, People's Hospital of Beizhen City, Beizheng 121307,China; 3 Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000, China）

ObjectiveTo prepare TF conjugated doxorubicin and Rg 3 loaded liposome and evaluate their properties and effect on the treatment of gastric cancer。MethodThe liposomes were prepared by thin fi lm hydration method. The ef fi ciency of cellular uptake on MKN-28 cells in vitro was evaluated. The anti-proliferation ef fi ciency of TF-LP-DOX/Rg 3 was evaluated by MTT assay. Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of TF-LP-DOX/Rg 3。ResultsThe result demonstrated that TF-LP uptaken by MKN-28 were 2.9 times higher than that of LP（P＜0.01）. The MTT assay and the inhibition of tumor spheroids in vitro con fi rmed strong inhibitory effect of TF-LP-DOX/Rg 3。ConclusionTF-LP-DOX/Rg 3 easily prepared and it is a potential delivery system for the treatment of gastric cancer.

transfferin; doxorubicin; Rg 3; liposome

R 735.2

A

1005-1678(2014)01-0009-04

辽宁省自然科学基金（3013022070）

李华，女，博士在读，主治医师，研究方向：消化道肿瘤的基础与临床，Email：1096485971@qq.com。朱志图，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：消化道肿瘤的基础与临床，Email：lyyyzhe@163.com。