早期补救ICSI在男性不育患者IVF-ET中的应用*

孙宝刚 王丽霞 曹井贺 张 宁 粱鲁南 杨爱军

(济宁医学院附属医院，山东 济宁 272029)

常规体外受精(in vitro fertilization,IVF)发生受精失败的概率约为5%～10%[1],目前不孕夫妇的相关检查均不能准确预测IVF结局。低受精的发生增加了卵母细胞的浪费，减少了可用胚胎的数量，给患者的经济及身心造成损害，因此IVF如何能及早观察受精情况，并早期进行补救，是预防受精失败的关键[2]。

1 对象与方法

1.1 研究对象

连续收集在济宁医学院附属医院生殖医学科就诊的89例不孕不育患者，根据受精方式不同分为男性不育IVF治疗组(A组)22例和男性不育卵胞浆单精子注射( intraoytopplasmic sperm injection，ICSI)治疗组(B组)(精子浓度≤15×106/ml，总活力PR+NP<40%或PR<32%；精子总数≤39×106/次；精子畸形率<96%)。并将以上两组作为试验组，以完全女方因素引起的IVF治疗组(C组)作为对照组(女性不孕因素有输卵管因素，其通过HSG或者宫腔镜、腹腔镜以及超声检查证实)。

1.2 方法

1.2.1控制性超促排卵 试验组与对照组女方均选择长方案超促排卵。于前次月经黄体中期肌注促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a) 0.03～0.1mg，月经第3天开始使用促性腺激素(gonadotropin，Gn) 150～225 Iu 共5d促排卵，月经第5天起，行阴道B超检查卵泡和子宫内膜发育情况，并以此及时调整用药。直至有2～3个主导卵泡直径在18mm以上时，结合激素检测结果提示卵泡发育成熟，停用促排卵药物，于当日注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5000～10000Iu。注射HCG后34～36h在阴道B超引导下穿刺取卵，记录取卵数。

1.2.2精子处理 将试验组与对照组的男性精液标本采用密度梯度分离法分离。其具体步骤为：取精子密度梯度分离培养基，吸取1ml下层(高密度)分离培养基置于离心管中，再吸取1ml上层分离培养基(低密度)缓慢地注于下层分离培养基的上面，两层培养基的中间形成一个清晰的界面，37℃培养箱复温。小心吸取1ml培养基化的精液覆盖于上层分离培养基的液面。以(300～600)g的速度离心20min。移去所有的分层溶液，只剩底部的沉淀。加2～3ml洗精培养基，将沉淀混匀。200g离心5min。移去上清，再加入洗精培养基，重复离心洗涤步骤。用0.5mlIVF受精培养基悬沉淀。进行精于计数和精子质量评估。将处理获得的精子调整密度(50～300)×103/ml为宜，后置5%CO2、37℃、95%湿度培养箱待用。

1.2.3受精及胚胎培养 A组和C组采用常规的体外受精。取卵后3h加精子，受精后4～6h后去除卵周颗粒细胞并观察第二极体是否排出，所有卵母细胞均无第二极体排出判断为完全不受精，排出第二极体卵母细胞数与成熟卵母细胞数之比<30%判断为低受精率，告知患者及家属，如同意补救，签署书面“早期补救ICSI知情同意书”，对A组患者未见到2个极体的卵子行早期补救ICSI治疗。B组患者直接采用ICSI治疗。

1.2.4胚胎按以下评分标准分级 形态学指标 4′-卵裂球大小均匀，碎片为≤5%;3′-卵裂球大小均匀或不等，碎片6%～20%;2′-卵裂球体积相等或不等，碎片21%～50%;1′-卵裂球少，碎片>50%。1、2级胚胎在发育过程中出现下列情况，胚胎评级时在形态学基础上降一级:1)授精20h内未见到原核，48h证实为延迟受精的胚胎。2)取卵后48h超过8细胞或72h未超过5细胞。正常受精3、4级胚胎为优质胚胎。取卵后培养24～48h观察胚胎形态，将优质胚胎移植到宫腔内。胚胎移植后14d检测尿或血HCG阳性，移植后3～5周超声检查见胎心搏动为临床妊娠。移植时先选择常规受精来源的胚胎，若无常规受精来源胚胎则移植ICSI受精胚胎。

1.2.5受精率、优质胚胎率、妊娠率的计算公式 受精率=正常受精卵数/卵—冠—丘复合体数×l00%；优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精卵数×100%；临床妊娠率=临床妊娠例数/移植周期数×100%。

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 试验组与对照组患者基本情况比较

两组患者男、女方年龄、不孕年限、精液量、非前向运动精子率(%)(NPR)相比较差异无统计学意义。精液参数中，精子浓度、前向运动精子率(PR)、正常形态率、精子存活率相比较，试验组高于对照组，差异有统计学意义。见表1。

表1 试验组与对照组患者基本情况比较

2.2 试验组与对照组临床治疗结局比较

22例男性不育患者行IVF受精，其受精率为43.37%，其中有5例受精率小于30%。对A组受精率小于30%患者实行早期补救ICSI后A组受精率为63.36%。比较试验组与对照组治疗结局：两组优质胚胎率、临床妊娠率、多精受精率差异均无统计学意义，其中补救前受精率B组及C组均大于A组，差异有统计学意义。但是经早期ICSI补救后受精率(%)，差异均无统计学意义。见表2。

3 讨论

精液常规检查一直作为一个很重要的参考指标来指导临床的治疗方案。伴随着男性不育研究的深入，传统的精液分析已不足以对男性生育能力做出准确全面的了解。本文发现，22例男性不育患者行IVF受精，其受精率为43.37%，其中有5例占行IVF助孕男性不育患者的比例为22.7%(5/22)受精率小于30%，明显低于B组(73.21%)以及C组(66.19%)，因此，男性不育患者还可能伴有精子功能缺陷，诸如精子与卵子的结合能力、精子顶体反应率明显下降，精子受精功能降低。精液常规分析与实际生育力的仅有70%的符合率[3]。有研究显示[4]，在IVF受精失败的病人中，约70%患者是由于精子与透明带结合障碍所引起[5]。因此即使精液检查指标均正常，也有可能出现受精失败。如果这部分患者做IVF治疗，其结果是受精率下降，甚至受精完全失败，导致无胚胎移植，往往会给病人带来精神及经济上的负担。

表2 试验组与对照组临床治疗结局比较(%)

Chen等[6]报道受精后22h行晚期补救ICSI 20例，仅成功1例，从而造成晚期补救性ICSI妊娠率和出生率低。而本文A组受精率小于30%，5例患者经6h内实行早期补救ICSI后A组受精率为63.36%，与B组以及C组相比无明显差异，并且之后的优胚率与妊娠率和B组以及C组相比，差异均无统计学意义。这与严正杰等[7]研究相符，他们发现IVF失败的患者，6h内尽早行补救ICSI可提高受精率，改善临床妊娠结局。因此早期补救ICSI有以下优势：1)伴有精子功能异常男性不育患者及时行早期补救ICSI，不仅可以提高受精率并且对以后的胚胎发育可能并无影响，这样大大改善了临床结局。2)可以使胚胎与子宫内膜发育更为同步，同时可以避免错过最佳的子宫内膜种植窗口。3)由于卵母细胞在体外培养的时间过长可以导致细胞内遗传物质发生异常，而对未受精的卵母细胞行早期补救ICSI则可以降低细胞内遗传物质发生异常的概率。因此早期补救ICSI可作为IVF失败后的补救措施。

我们对于首次行IVF治疗的男性不育患者，如果男性不育患者妻子获卵数≤5枚，在受精后6h内则全部拆蛋观察；获卵数≥5枚者则拆一孔或一皿卵子进行观察。对其未见到2个极体的卵子行早期补救ICSI治疗。这样有利于提高受精率，避免完全受精失败，获得较好的妊娠结局，也可为以后的治疗提供更好的方案，并且可以降低ICSI的操作率，降低患者的治疗费用。

综上所述，在IVF受精后对未受精的卵母细胞实行早期补救ICSI，不但避免了受精失败导致的无胚胎移植，显著增加妊娠机会，而且还可避免为了提高受精率而过度使用ICSI技术的情况。早期补救ICSI是一种高效、可行的挽救常规受精失败的措施。然而早期补救ICSI技术对出生婴儿的安全性研究随访报道较少，我们尚不清楚在卵母细胞受精过程中进行拆除颗粒细胞等机械操作是否会对受精卵和胎儿产生遗传学方面的不良影响。

[1] Mahutte NG,Arici A.Failed fertilization:is it predictable?[J].Current Opinion Obstet Gynecol,2003,15(3):211-218.

[2] Amarin ZO,Obediat BR,Rouzi AA,et al.Intracytoplasmic sperm injection after total conventional in-vitro-fertilization failure[J].Saudi Med J,2005,26(3):411-415.

[3] Kennedy WP，Kaminski JM，Van der Ven HH，et al．A simple clinicalassay to evaluate the arcsine activity of human spermatozoa[J].J Androl,1989，10 (3):221-231．

[4] Liu DY,Clarke GN,Martic M,et al.Frequency of disordered zona pellucida (ZP)-induced acrosome reaction in infertile men with normal semen analysis and normal spermatozoa-ZP binding[J].Hum Reprod,2001,16(6):1185-1190.

[5] Liu DY,Baker HWG．Defective sperm zonal pellucid interaction：a major cause of failure of limitation in clinical in-vitro fertilization[J].Hum Reprod,2000，l5 (3)：702-708．

[6] Chen C,Kallera S.Resue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6h post-insemination in conventional IVF[J].Hun Reprod,2003,18 (10):2118-2121.

[7] 严正杰,蔡令波,冯婷，等.对体外受精失败后不同授精时间进行补救ICSI 的结局比较[J].生殖与避孕，2009，29(5)：329-332.