RhoC和Ki-67蛋白在翼状胬肉中的表达与临床病理特点的关系

顾秋艳

(河北省邢台医学高等专科学校，河北 邢台 054000)

翼状胬肉从异常的结膜组织向角膜缘和角膜生长，外形表现呈翼状，是世界范围内最常见的眼科疾病，可破坏角膜缘干细胞使角膜组织结膜样化[1]，病因至今不明。翼状胬肉影响美观，侵袭至角膜可因牵拉而造成难以矫正的散光，影响视力甚至眼球运动。流行病学研究显示翼状胬肉的发生、发展与长期接受慢性阳光和紫外线照射有关。翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术是治疗翼状胬肉的较好方法，但术后复发率较高[2]。一些辅助治疗如MMC的应用、β射线放疗等措施又易造成严重并发症[3]。组织病理学改变主要表现为高度纤维血管化及富含弹性纤维变性的结缔组织、角膜上皮基底膜的破坏，纤维组织侵入Bowman层及角膜基质浅层。Ras同源性原癌基因C(RhoC)是原癌基因超家族的重要成员之一，为GTP结合蛋白，是细胞信号转导通路的重要分子。研究表明RhoC参与了肿瘤发生、发展的每个环节，主要机制是通过调控细胞生长周期、影响细胞的增殖和凋亡、调节肌动蛋白的聚离等完成[4]。因此，研究RhoC的表达可能成为肿瘤细胞增生和浸润的指标之一，能为预防肿瘤转移提供特异性、多靶位的治疗方法。国内未见RhoC在翼状胬肉中表达的报道。Ki-67是一种非组核蛋白，与细胞增殖相关，常定位于细胞核，半衰期较短，是目前公认的评价细胞增殖状态的稳定指标。本研究选取45例翼状胬肉患者标本和16例正常球结膜标本，采用免疫组织化学方法检测RhoC和Ki-67蛋白的表达情况，旨在为胬肉的化学药物治疗和靶向治疗提供一定的思路，有效判断患者翼状胬肉的发病及复发情况并早期采取相关治疗措施，减轻患者痛苦及经济负担。

1 研究资料

1.1标本来源 实验材料来源于邢台医学高等专科学校第二附属医院眼科门诊2011—2013年手术切除的标本。翼状胬肉45例，男24例，女21例；平均年龄61.2岁；进展期31例，静止期14例。正常球结膜16例，取自白内障、视网膜脱离手术的角巩膜球结膜。均已于术前告知患者并取得患者同意。

1.2翼状胬肉标本的分期标准[5]静止期：表现为特异薄膜状态，表面光滑，头部扁平，角膜组织发生浸润和吸收，混浊区面积小且境界清楚，组织体部无充血；进展期：表面光滑不平，头部胶样隆起，组织体部肥厚，角膜前弹力层和实质浅层等多个部位均已受到侵及，部分细胞浸润至组织头部，附近的角膜组织混浊，血管粗大且呈扩张和充血等严重状态。

1.3实验试剂和主要仪器 试剂：羊抗人RhoC多克隆抗体 (产品编号SC-12116)购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人Ki-67单克隆抗体浓缩液(产品编ZM-01660)、S-P免疫组化试剂盒、浓缩型显色剂(DAB)等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器设备有BX41显微镜、多功能真彩色细胞图像分析管理系统来自日本OLYMPUS公司；BW-Ⅱ型病理组织包埋机来自安徽电子科学研究所；135型切片机来自德国LEICA公司；CS-VI型摊片烤片机来自孝感宏业医用仪器有限公司；ZD-IIIB型医用微波炉来自上海中达医学研究所。

1.4实验方法 免疫组化法(S-P法)：将手术切除的组织立即放于生理盐水中涮净血液，整形并展平，常规置于10%的中性甲醛溶液中固定24 h。所取组织依次经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，蜡块编号及修块等程序后，调整切片机厚度至5 μm，连续切割以形成蜡带。捞片、展片，并粘贴在预处理好的载玻片上，放置于60 ℃烤箱内过夜。每个蜡块均切片7张。粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明，然后封片。切片放于湿盒内，加入3%H2O2溶液(A液)，室温孵育20 min以消除内源性过氧化物酶的影响。再将切片放入修复盒中，加入枸橼酸抗原修复液(pH值6.0)，置于微波炉中，先后以80%的火力和40%的火力，分别持续加热2 min和6 min，进行抗原修复。在室温下自然冷却后倒出抗原修复液。取出载玻片放置于湿盒中，为消除非特异性染色，滴加正常山羊血清工作液(B液)。切片放入湿盒中置于37 ℃恒温箱内孵育30 min，防止非特异性抗体干扰。滴加RhoC一抗(浓度1∶100)和Ki-67一抗(浓度1∶50)，加入之前分别用0.01 MPBS液稀释。切片放入湿盒中于4 ℃冰箱过夜。第2天取出后放置30 min降至室温，在切片上先后滴加二抗工作液(C液)和链霉卵白素工作液(D液)，然后将湿盒置于37 ℃恒温箱中孵育30 min。室温条件下滴加新鲜配制的DAB显色液，在显微镜观察下掌控显色时间，然后用自来水冲洗终止显色。常规进行切片的复染、脱水、透明及封片。RhoC和Ki-67分别以胃癌组织和乳腺癌组织做阳性对照，以0.01 mol/L PBS液替代一抗做阴性对照。

1.5结果判定 将一侧目镜配以计数格(5 mm×5 mm，6×6条线)，每张切片先在低倍镜下找到阳性细胞密集区域，然后随机计数10个阳性区域的有代表性的高倍视野(染色明显、无明显背景着色)。RhoC蛋白的表达定位于细胞质和细胞膜，阳性信号呈黄色、棕黄色、棕褐色颗粒状。Ki-67定位于细胞核，阳性反应为细胞核呈棕褐色颗粒状。阳性细胞百分比=(阳性细胞数/计数细胞总数)×100%。RhoC和Ki-67蛋白的表达情况根据染色强度及染色阳性细胞百分率计分。

1.6统计学方法 所有数据输入计算机，用Excel进行数据整理后，再用SPSS 15.0统计软件包进行分析处理。应用秩和检验和Spearman等级相关分析将实验结果进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1RhoC蛋白的表达 免疫组化结果显示正常球结膜上皮和基质层各细胞均未见RhoC蛋白表达。翼状胬肉组织中RhoC的阳性信号呈黄色、棕黄色、棕褐色颗粒状，多位于上皮层细胞的细胞质和细胞膜的胞浆中，在基质层各细胞未见表达，见图1。RhoC蛋白在翼状胬肉中的阳性表达率明显高于正常球结膜组织(Z=-3.285,P<0.05)，见表1。不同分期的翼状胬肉RhoC蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义(P均>0.05)；RhoC蛋白在不同年龄、不同性别患者间的表达差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

图1 RhoC在翼状胬肉中的表达

例

表2 不同临床病理参数下RhoC在翼状胬肉中的表达情况 例

2.2Ki-67蛋白的表达 免疫组化结果显示正常球结膜中有少量的Ki-67在基底细胞有表达，阳性率为25%(4/16)。翼状胬肉中的Ki-67阳性表达呈细胞核型，呈现棕黄色及棕褐色颗粒，主要分布在上皮细胞的基底部，见图2。翼状胬肉中Ki-67的阳性表达明显高于球结膜(Z=-2.677,P<0.05)，见表3。Ki-67蛋白在不同分期翼状胬肉中的阳性表达率比较差异有统计学意义(P均<0.05)；Ki-67蛋白在不同年龄、不同性别患者间表达差异无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

图2 Ki-67在翼状胬肉中的表达()

例

表4 不同临床病理参数下Ki-67在翼状胬肉中的表达情况 例

2.3RhoC与Ki-67相关性分析 Spearman等级相关分析显示，RhoC和Ki-67之间不具相关性(r=0.378，P>0.05)。

3 讨 论

RhoC是Ras基因超家族的重要成员，基因定位于lpl3-p21，它可以使肌动蛋白的轻链磷酸化，借此成为细胞信号通路上的重要传导分子，从而参与和调节细胞的生长、凋亡和细胞周期的变化。研究发现，RhoC通过调节细胞骨架相关蛋白的磷酸化，使肌球蛋白与肌动蛋白丝相互作用，以促进细胞运动和迁移，其激活或失活状态可以间接影响其他分子对肿瘤细胞的调节活动，其作用机制的研究可以为肿瘤的调控提供研究思路[6]。RhoC蛋白被称为肿瘤侵袭转移的分子开关，在肿瘤细胞的游走过程中起着关键作用，对肿瘤转移的作用尤为突出，通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡而促使细胞发生癌变。已有研究表明 RhoC 与多种肿瘤(如肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌等)的侵润、转移、临床分期及预后密切相关[7]。RhoC基因可作为判断肿瘤转移及预后的参考指标之一，已成为靶向治疗肿瘤的热点。RhoC高表达可能提示肿瘤有较高侵袭性和预后不良[8]。

本研究采用免疫组织化学方法证实RhoC在翼状胬肉上皮呈现高表达，显示翼状胬肉具有类似肿瘤组织的特点：其病理特征表现是上皮细胞和基质成纤维细胞的增殖，同时伴有新生血管形成和炎症侵润。张明昌等[9]认为翼状胬肉的生长与角膜缘干细胞的缺陷和转化异常有关。本研究发现60%的翼状胬肉上皮组织呈RhoC阳性表达，这些都表明翼状胬肉发病机制中上皮细胞的改变有重要的作用。翼状胬肉不是退行性病变，是一种良性肿瘤样病变，类似肿瘤发生前性质[10]。本研究结果支持翼状胬肉具有肿瘤特性这一学说。RhoC可以通过使肿瘤细胞易于游走及重塑细胞外基质的能力，使肿瘤细胞具有局部侵润性。以上作用机制导致翼状胬肉新生血管纤维的形成，使得翼状胬肉细胞外基质改变、构建新生血管网，形成异常增殖。

在增殖细胞中发现的Ki-67核抗原是在1983年由Gerdes首次发现的。是目前应用最为广泛的、被认为是能较可靠全面地反映细胞群体增殖活性的客观指标[11]。基本上所有组织中都有Ki-67的表达，其增殖的活跃度与肿瘤分级、预后均有一定关系。本研究发现翼状胬肉中上皮细胞Ki-67明显阳性表达，表明了翼状胬肉组织细胞发生异常增殖调控，胬肉的上皮及间质细胞和正常结膜处于不同的细胞分裂周期，导致组织过度增殖，其中进展期的翼状胬肉增殖尤其活跃，该期胬肉Ki-67阳性表达率明显高于静止期。

经过Spearman等级相关分析，RhoC和Ki-67之间不具相关性(r=0.378，P>0.05)。提示这2种蛋白是通过侵袭、破坏细胞ECM和异常增殖等不同作用机制促使球结膜组织发生改变，导致翼状胬肉的发生。

综上，RhoC及Ki-67在翼状胬肉中的表达明显高于正常球结膜，表明翼状胬肉组织中基底膜分解代谢和细胞增殖调控等方面发生异常变化，这在翼状胬肉的发生发展中起着重要的作用。

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