一株高效溶磷细菌的筛选鉴定及溶磷效果的研究

李娜，洪坚平，谢英荷，乔志伟，李元，张平

(山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801)

一株高效溶磷细菌的筛选鉴定及溶磷效果的研究

李娜，洪坚平，谢英荷，乔志伟，李元，张平

(山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801)

从石灰性土壤中分离筛选出一株高效溶磷细菌W05，通过形态观察和生理生化以及16sRNA对其进行了鉴定，确定此菌株属于假单胞菌属，将它培养7 d后，磷酸三钙、磷矿粉、磷酸铁和磷酸铝培养液中的磷含量分别为563.5、21.27、149.54、88.06 mg·L-1。将W05与鸡粪混合制成溶磷菌肥，盆栽油菜试验结果表明：溶磷菌肥显著提高土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜产量与吸磷量；同时施用磷矿粉，各项指标均显著提高，比起单施菌肥处理，磷矿粉施入量为1 g·盆-1时，土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜鲜重、干重、吸磷量分别增加了46.4%、7.1%、9.6%、9.7%、3.1%；磷矿粉施入量为2 g·盆-1与1 g·盆-1处理相比，上述指标分别增加了14.8%、2.5%、1.4%、22.0%、5.9%；但是，磷矿粉施入量为3 g·盆-1与2 g·盆-1的各项指标差异不显著。可见，将一定浓度磷矿粉与溶磷菌混合使用，可以提高磷矿粉有效性，增加土壤有效磷含量。

溶磷细菌；溶磷菌肥；磷矿粉；溶磷作用

磷是植物生长所必需的矿质元素，在植物生长、发育等生命活动中起着积极的作用[1]。山西的土壤以石灰性土壤为主，全磷含量约在0.10%～0.15%之间[2]，但大部分磷素由于被固定而处于无效状态[3]，土壤中可被植物吸收利用的磷仅占全磷量的1%[4]全省耕地土壤缺有效磷的现象十分严重，大量施用磷肥不仅增加了农业生产成本，而且造成了资源的浪费，同时也引起了环境污染。

土壤中含有大量的微生物，能够将难溶性磷转化为植物直接可吸收利用的可溶性磷[5]。

有关溶磷微生物研究和应用，我国已有60多年历史[6，7]，有关溶磷菌对磷矿粉的溶解作用，大多是室内液体培养条件下的研究结果[8]，少量的实际应用研究也是将溶磷微生物作为肥料直接施入土壤，监测其对土壤有效磷含量的影响和对作物的促生作用[9，10]，对施入土壤磷矿粉的溶磷作用研究较少。本试验从山西农业大学农学院实验站土壤中分离筛选出一株高效溶磷细菌W05，通过形态观察和生理生化以及16sRNA对其进行了鉴定，并将其与有机肥混合制成菌肥，通过油菜盆栽试验，研究了溶磷菌肥对不同磷矿粉用量土壤养分和油菜产量的影响，为溶磷菌生物有机肥合理施用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 分离筛选土样

供试土壤取自山西农业大学农学院实验站。

1.2 培养基

1.2.1 初筛培养基(改良后的PVK培养基)

葡萄糖10 g，磷酸三钙5 g，硫酸铵0.5 g，酵母浸膏0.5 g，氯化钠0.2 g，氯化钾0.2 g，硫酸镁0.1 g，硫酸亚铁0.002 g，硫酸锰0.002 g，0.4%溴酚蓝(pH 6.7)6 mL，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。

1.2.2 复筛培养基(NBRIP培养基)

葡萄糖10 g,磷酸三钙5 g，氯化镁5 g，硫酸镁0.25 g，硫酸铵0.1 g，氯化钾0.2 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

1.2.3 活化培养基(NA细菌培养基)

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL。

1.3 溶磷菌的分离筛选和溶磷能力的测定

1.3.1 分离筛选

称取10 g新鲜土样溶于90 mL无菌水中，用10倍稀释法分别配制10-5、10-6、10-7的土壤悬液，分别涂布至分离培养基上, 30℃培养2～4 d，观察出现溶磷圈的菌落, 根据是否产生溶磷圈来初步确定筛选的溶磷细菌，用平板划线分离纯化后保存于细菌培养基斜面上。

1.3.2 溶磷作用

将细菌培养基上培养48 h的菌接入无菌水中，充分振荡摇匀，制备成菌悬液，菌数大于108CFU·mL-1备用。在250 mL三角瓶中加入100 mL已灭菌的NBRIP液体培养基和难溶态磷酸盐(磷酸三钙，磷矿粉，磷酸铁和磷酸铝)，加入量为5 g·L-1，接种菌悬浮液1 mL，于30℃ 150 r·min-1下振荡培养。培养7 d后取发酵液在4℃ 6000 r·min-1离心10 min，取上清液测定发酵液中磷含量，并设置不接菌处理，每个处理重复3 次。

1.4 鉴定

1.4.1 形态和生理生化鉴定

参照《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)[11]进行形态观察和生理生化试验。

1.4.2 16SrDNA序列测定

采用引物7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)，1540r (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)建立扩增反应体系并测序，将获得的DNA序列输入GenBank，用Blast程序与数据库中所有序列进行比对，根据亲缘关系确定其种属。

1.5 盆栽试验

1.5.1 供试土壤

供试土壤取自山西农业大学资源环境学院实验站0～20 cm耕层土壤，属于石灰性褐土，基础土壤养分含量为：全氮1.31 g·kg-1、碱解氮36.34 mg·kg-1、全磷0.23 g·kg-1、有效磷15.56 mg·kg-1、全钾1.26 g·kg-1、速效钾97.41 mg·kg-1、有机质14.27 g·kg-1、pH 7.6。

1.5.2 供试作物

油菜，品种为四月蔓。

1.5.3 供试肥料

1)多酶金缓释尿素：来自永济中农化工有限公司，含氮量为46%；

2)磷矿粉：秦皇岛市抚宁化学工业有限公司；含五氧化二磷磷量为19%；

3)硫酸钾：晋中开发区中资化工技术有限公司，含氧化钾54%；

4)磷细菌肥：将W05发酵培养后与风干鸡粪按1∶4的比例混匀制成。活菌数大于5×107CFU·g-1。

1.5.4 试验设计

盆栽试验于2013年4-6月在山西农业大学资源环境学院实验站日光温室内进行。试验用盆钵为盆底直径30 cm，高27 cm的聚乙烯塑料盆, 土壤过2 mm筛后，每盆装风干土5 kg。试验设计方案见表1，共15个处理，每个处理3次重复。

表1 试验设计/g·盆-1

1.5.5 测定项目与方法

在油菜收获后采集土壤样品，土样自然风干、研磨，过1 mm筛，测定其有效磷含量-NaHCO3浸提-钼锑抗比色法；磷酸酶活性-磷酸苯二钠比色法；植物吸磷量-钒钼黄比色法。

1.6 统计分析

采用Excel、SAS软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌的分离、筛选

经过对采集的土样进行溶磷菌的分离和初筛，初筛得到8 株溶磷细菌，经过筛选和活化，部分菌株降低或失去溶磷作用，不再生长，最终筛选出一株溶磷能力稳定且长势良好的溶磷细菌W05。该菌株短杆状，无芽孢，直径0.5～1.0 mm，在细菌培养基平板上为黄色，表面干燥，无凸起，革兰氏阴性菌。经过鉴定，菌株W05的序列长度为1454 bp，通过BLAST软件与Genbank中的序列比较，得到W05菌株与Pesudomonas sp (JF820 108.1)、Pesudomonas sp (AM934 699.1)及Pesudomonas sp(KC195 898.1)的序列同源性均大于99%，结合其形态和生理生化反应，鉴定其为Pesudomonas sp。

2.2 W05溶磷能力

W05对磷矿粉、磷酸铝和磷酸铁的溶磷能力如表2，W05对磷矿粉、磷酸铁和磷酸铝的溶磷量分别为21.27、149.54、88.06 mg·L-1，由表2可知，溶磷细菌W05对各种难溶态磷酸盐都有一定的溶解能力。

表2 溶磷细菌W05对难溶态磷酸盐的溶解能力

2.3 土壤有效磷、有机磷、磷酸酶及油菜产量

2.3.1 溶磷菌肥与不同浓度磷矿粉配施对油菜土壤有效磷、磷酸酶、有机磷的影响

由图1左图可以看出各处理油菜土壤有效磷含量显著高于CK处理。单施菌肥的处理(处理1)比CK处理,有效磷含量增加了128.67%。土壤有效磷含量随磷矿粉施入量的增加而增加，施入磷矿粉1 g·盆-1时土壤有效磷含量显著高于单施菌肥的处理，增加了46.43%，随着磷矿粉施入量增加，土壤有效磷含量依次增加了14.76%、0.60%，但处理1、2、3之间差异不显著。

由图1右图可以看出各处理油菜土壤磷酸酶活性显著高于CK处理。单施菌肥的处理(处理1)比CK处理磷酸酶活性增加了14.46%。土壤磷酸酶活性随磷矿粉施入量的增加而增加，施入磷矿粉1 g·盆-1时土壤磷酸酶活性显著高于单施菌肥的处理，增加了7.08%，随着磷矿粉施入量增加，呈增速降低的趋势，处理1、2、3之间差异不显著，依次增加了2.48%、降低了0.77%，可见磷矿粉施入2 g·盆-1和3 g·盆-1时，土壤磷酸酶活性变化很小。

图1 不同浓度磷矿粉处理对油菜土壤有效磷含量和磷酸酶活性的影响

2.3.2 溶磷细菌与不同浓度磷矿粉配施对油菜产量及吸磷量的影响

由表3可知，各处理油菜产量和吸磷量均比CK高，可见施入菌肥可提高植物产量，比较处理1、2可知，施加磷矿粉，油菜鲜重、油菜干重、吸磷量显著增加，分别增加了9.6%、9.7%、3.1%。 随磷矿粉施入量的增加，油菜产量和吸磷量增加，但增加幅度降低，施入量1 g·盆-1和2 g·盆-1两个处理，油菜干重、吸磷量差异显著，磷矿粉施入量3 g·盆-1的处理比2 g·盆-1的处理，油菜鲜重、吸磷量的增加不显著，油菜干重略有降低，降低的也不显著，即施入磷矿粉2 g·盆-1与3 g·盆-1的处理油菜生长差异不显著，这表明，在每盆施入菌肥10 g后，施入磷矿粉2 g·盆-1和3 g·盆-1这两个处理作用效果差不多，所以可以适量减少磷矿粉的施入量来节约成本。

表3 不同浓度磷矿粉处理的油菜产量及养分含量

3 讨论与结论

本试验从石灰性土壤中分离筛选出一株高效溶磷细菌W05，鉴定其为假单胞菌属，培养7d后W05在磷酸三钙、磷矿粉、磷酸铁和磷酸铝培养液中的有效磷含量分别为563.5、21.27、149.54、88.06 mg·L-1，可见W05具有高效地溶解磷酸三钙的能力，并且对磷矿粉、磷酸铝、磷酸铁都有一定的溶解能力，因此W05可以作为溶磷菌肥的优质菌株。

本试验表明加入溶磷菌生物有机肥，提高了土壤中有效磷，改善了植物生长情况，使其产量增加。即施入溶磷细菌生物有机肥，土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜产量与吸磷量显著高于CK，分别提高了128.67%，14.46%，17.11%(鲜重)，76.53%(干重)，19.74%。表明溶磷微生物把难溶性磷转化为有效态磷，促进植物对磷素的吸收和生长发育。

本试验施入磷矿粉时，土壤有效磷含量及油菜产量、吸磷量显著高于单施菌肥，即加入一定量难溶性磷磷矿粉，促进了溶磷菌的产酸产酶能力，加速了溶磷菌对难溶性磷的溶解。施入磷矿粉比单施菌肥，各项指标均显著增加，磷矿粉施入量为1 g·盆-1的处理比单施菌肥处理，土壤有效磷含量、磷酸酶活性、油菜鲜重、干重、吸磷量分别增加了46.4%、7.1%、9.6%、9.7%、3.1%。磷矿粉能为微生物提供养料, 同时微生物能将磷矿粉中的磷转化为植物可以直接利用的磷素。溶磷微生物产生质子和有机酸，通过交换、水解、络合、整合等作用，使磷矿粉分解，不仅释放出磷酸盐，而且也释放出钙、镁、钠等离子，这些离子的水解将使培养液的酸度降低[12]。

本试验比较了磷矿粉施入量为2 g·盆-1以及3 g·盆-1两个处理，土壤有效磷含量及油菜产量、吸磷量的变化均不显著。磷矿粉施入量为3 g·盆-1的处理和2 g·盆-1的处理各项指标差异不显著。加入磷矿粉在一定范围内促进了溶磷菌的活性，但是施入量超过一定范围时，由于溶磷细菌的活性有限，其溶磷活性不再随磷矿粉施入量的增加而显著增加。Narsianamp;Patel[13]发现Aspergillus aculeatus的溶磷量随着磷矿粉加入量的增加而降低。

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TheIdentificationofaHighlyEfficientPhosphateSolubilizingBacteriumandItsImpactonOilrape

Li Na, Hong Jianping, Xie Yinghe, Qiao Zhiwei, Li Yuan, Zhang Ping

(CollegeofResourcesandEnvironment,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

We isolated a phosphorus dissolving bacteria strain names as W05 with strong phosphate-solubilizing activity from calcareous soil. It it belongs to the genus Pseudomonas based on its morphological, physiological and biochemical properties and the analysis of 16sRNA gene sequence. After cultivating 7 d, the phosphorus content in tricalcium phosphate, phosphate rock powder, ferric phosphate and aluminum phosphate liquid culture was 563.5、21.27、149.54、88.06 mg·L-1, respectively. We made soluble phosphorus bacterial manure by mixing W05 with chicken manure, which was used for the following research. The results of potted rapeseed experiment show that: soluble phosphorus bacterial manure could increase soil available phosphorus content, phosphatase activity, rapeseed production and the uptake of phosphorus. Compared with single application of fertilizer, soil available phosphorus content, phosphatase activity, rapeseed fresh weight, dry weight and the uptake of phosphorus increased 46.4%、7.1%、9.6%、9.7%、3.1% with applied phosphate rock 1 g·pot-1, respectively. These indicators with the treatment of applied phosphate rock 2 g·pot-1were 14.8%、2.5%、1.4%、22.0%、5.9% higher than the treatment of applied phosphate rock 1 g·pot-1, respectively. However, the difference of each indicator was not significant between the treatment of applied phosphate rock 3 g·pot-1and 2 g·pot-1. Thus, application of a certain concentration of phosphate rock with phosphorus bacteria fertilizer into the soil could improve the phosphorus removal efficiency from phosphate rock and increase soil available phosphorus content.

Dissolved phosphorus bacteria; Soluble phosphorus bacterial manure; Phosphate rock powder; Dissolving effect

2014-07-03

2014-08-28

李娜(1989-)，女(汉)，山西太原人，在读硕士研究生，研究方向：微生物肥料的研制与应用。

S154.3

A

1671-8151(2014)06-0526-05

(编辑：武英耀)