罗非鱼皮胶原基生物医用材料的制备与表征

王南平, 何兰, 郭休玉，顾其胜

上海市水产研究所加工研究室(上海，200433)

罗非鱼皮胶原基生物医用材料的制备与表征

王南平, 何兰, 郭休玉，顾其胜

上海市水产研究所加工研究室(上海，200433)

目的取自罗非鱼皮制备符合医用级胶原蛋白制品，供人体临床使用。方法从罗非鱼皮中藉分级分离提取纯化获得高纯度胶原蛋白样品，用 SDS-PAGE电泳，FI-IR红外光谱，ELASA法以及扫描电镜对该样品进行全面表征。罗非鱼皮中分离获得的胶原蛋白属I型，羟脯氨酸含量为10.09%，胶蛋白蛋含量为98.47%，纯度在95%以上，其抗原性低于牛胶原蛋白，其玻璃化转化温度在26～28 ℃，热溶解温度都在42 ℃。结论结果表明，自罗非鱼皮制备的胶原蛋白完全符合医用级水平，可以安全地用于人体临床的止血和修复。

胶原蛋白；医用材料；修复

0 引言

胶原蛋白是动物体内含量最多且分布最广的结构性蛋白质[1]，由三条肽链组成的三螺旋结构，这些都赋予它很多有用的特性，如：高拉伸强度，生物可降解性、低抗原活性、低刺激性和低细胞毒性以及促进细胞生长的性能[2]，由于这些优良的生物学性能使之成为一种重要的天然可降解生物医用材料而被人体临床广泛应用。

在低等动物和哺乳动物中均广泛存在胶原蛋白。陆生动物的猪、牛是主要的胶原蛋白来源，同样，在水生动物中，如鱼、软体动物、环节动物、棘皮动物等都含有丰富的多重结构类型的胶原蛋白。鱼胶原蛋白主要分布在皮和鳞两个部分，并主要以I型或I型的亚型结构存在，在鱼皮中胶原蛋白含量占粗蛋白含量的80%～90%[3]。

水生动物的胶原蛋白与陆生动物的胶原蛋白在结构成份上的主要区别是亚基氨基酸含量。水生动物胶原蛋白的亚氨基酸含量低于陆生动物胶原蛋白，这可能是温度条件的变化所致[4]。由该成分所引起肽链交联度的变化、热收缩温度、玻璃化转化温度的变化，相应都会影响胶原蛋白分离技术的实施，胶原的物理和生物学特征的改变。因此开展研究鱼皮胶原的分离提取技术研究及其表征的研究，对于推进鱼胶原蛋白在生物医用材料领域的应用是十分必要的。

1 材料与方法

1.1原料

罗非鱼皮(Tilapia)取自广东湛江遂溪水产养殖场，鱼个体450～500 g/条，清洗去鳞取皮，去除附着鱼肉和鳍，获得200 g罗非鱼皮，切成2 cm×2 cm小块，备用。

1.2鱼皮前处理

1.2.1 将切成小块的罗非鱼皮，放入0.1 mol/L 的NaOH溶液中，料液比1:10(w/v)连续搅拌(80 rpm)，水温控制在4 ℃以下，每隔4 h更换一次碱液，重复4次，再用去离子水反复清洗至pH 6.5～7。

1.2.2 将碱处理后的鱼皮放入4%浓度的NaCl溶液中，料液比 1:10(w/v)，连续搅拌(80 rpm)，水温控制在4 ℃以下，每隔4 h更换一次盐液，重复4次，再用去离子水反复清洗，将NaCl清洗干净。

1.2.3 将盐洗后的鱼皮放入无水乙醇浸泡，料液比1:5，4 h后，更换无水乙醇，再用去离子水将乙醇反复清洗干净。

1.3酸溶性胶原的分离

将鱼皮捣碎放入0.5 mol/L的乙酸溶液中，料液比1:20(w/v)，搅拌(60 rpm)6 h后，用40目纱网过滤，去除残渣。取滤液用冷冻高速离心机(HITACHI centrifuge CR20B2)离心，4 ℃，8 000 g，20 min。取上清液获得酸溶性分离胶原ASC(acid-soluble collagen)。

将ASC胶液加入NaOH，将胶液调pH至5.5，再加入0.3%的胃蛋白酶，在4 ℃条件下连续搅拌48 h，再用NaOH调至pH值6.5，即获得胃蛋白酶水解胶原PSC(pepsine-soluble collagen)，在PSC溶液里加入NaCl至终端浓度为4%，静置4 h，然后低温4 ℃条件下离心10 000 g，30 min，取沉淀的胶原。

1.4胶原的纯化

将盐析胶原加入纯水，料液比1:4，搅拌(80 rpm)，将胶原重新溶解，装入透析袋中透析，透析袋截留分子量为100 KD，透析外液为磷酸盐缓冲液(85% 1/15 M Na2HPO4，15% 1/15 M KH2PO4，pH 7.5)，在4 ℃条件下透析3天，每12 h换透析外液一次，将经透析纯化的胶液用-60 ℃冷冻干燥机冻干。

1.5氨基酸测定

取一定量胶原蛋白样品,在减压充氮条件下用6 mol/L HC1 于110 ℃水解24 h。采用Agilent1100高效液相色谱仪对样品进行检测。

1.6SDS-PAGE电泳测定

参照Laemmli的电泳方法，将冷冻干燥的胶原蛋白溶于Tris-HCl缓冲液(50 m mol/L, pH 7.4, 25 ℃)，取400 μg/mL的胶原蛋白制品10 μL，加入10 μL 2×SDS样品缓冲液。配制5%浓缩胶、8%分离胶，每孔加10 μL样品液。在25 mA下电泳。电泳后考马斯亮蓝染色，脱色后扫描记录。

1.7FT-IR红外光谱测定

将一定量干燥的KBr和胶原蛋白冻干品置于玛瑙研钵中，研磨均匀，成粉末状，装样，手动压片，取出样品小心放入样品室。采用Nicolet-SX-170傅立叶红外光谱仪对样品在400～4 000/cm扫描，扫描信号累加200次，分辨率为4/cm。

1.8等电点测定

根据《中国药典》2010第三部附录IV等电聚焦电泳法测定胶原蛋白等电点。

1.9变性温度测定

冷冻干燥的胶原蛋白样品紧密装入160 μL DSC测定用铝盒，另一空铝盒为对照，DSC扫描温度范围10～85 ℃，升温速率2 ℃/min。

1.10酶联免疫法检测蛋白抗原性

取成年实验大鼠，按照7.2 mg/kg量进行胶原蛋白腹部注射，培养1周时间，断尾取血200 μL，自然凝固离心取上清，根据大鼠Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)酶联免疫分析试剂盒说明书操作，测定大鼠血清、样本中I 型胶原蛋白(COL-I)含量。

1.11电镜

将干燥的胶原蛋白样品用导电性好的粘合剂粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层50～300 A°厚的金属膜，用JSM-5610扫描电镜观察。

2 结果与讨论

2.1罗非鱼皮的基本成分

罗非鱼皮主要化学成分是：水分67.4%，灰分1.3%(湿基)，蛋白质28.4%(湿基)，脂肪1.1%(湿基)，这些基本成分与叶小燕(2008)所测得的数据基本相似。

2.2罗非鱼皮胶原蛋白氨基酸组成

罗非鱼皮胶原蛋白氨基酸组成如表1所示，其含量以每1 000个总氨基酸残基中的残基数表示。

表1 鱼胶原蛋白的氨基酸组成Tab.1 Composition of amino acid in collagen of fish

表1的数据表明，胶原蛋白中不含有色氨酸和胱氨酸，甘氨酸约占氨基酸总量的1/3，符合胶原分子一级结构氨基酸G-X-Y的肽链组合特征，甘氨酸含量为33.4%，羟脯氨酸与脯氨酸之比为0.77，并且羟脯氨酸高于羟赖氨酸，具有I型胶原的氨基酸组成特点[1]。

表征胶原纯度的氨基酸分析结果表明：羟脯氨酸10.03%≥9% ，色氨酸未检出，符合医用级胶原的技术要求。

罗非鱼皮的亚基氨基酸含量为190残基。由于淡水鱼生活的水温环境相似，鲤鱼皮的亚基氨基酸186[6]结果基本一致。动物之间的亚基氨基酸含量的差异与它们的生活环境差异有关，特别与栖息地的温度有关。

2.3SDS-PAGE电泳分析

罗非鱼皮胶原蛋白电泳如图1所示。

图1 罗非鱼皮胶原蛋白SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE map of tilapia skin collagen

电泳如图1所示4条肽链，分别为330.30 KD，263.64 KD，118.47 KD与109.64 KD。第一条带显示未解螺旋的胶原，即[α1]2[α2]，第二条带显示胶原蛋白的二聚体，第三条带和第四条带分别是α1、α2肽链，α1的分子量略大于α2，α1和α2肽链的分子量，与参考文献[8-9](Huang Y, 2011)一致。

四条带的纯度分别为4.84%、48.37%、35.21%与10.05%，胶原含量为98.47%，符合医用材料要求纯度大于95%的要求。

2.4傅里叶红外光谱

罗非鱼皮胶原傅里叶变换红外光谱图见图2、图3。

图2 罗非鱼皮胶原傅里叶变换红外光谱400～4000波数 Fig.2 FTIR map of tilapia skin collagen (wave 400～4000)

图3罗非鱼皮胶原傅里叶变换红外光谱1600～1700波数
Fig.3FTIRmapoftilapiaskincollagen(wave1600～1700)

酰胺A波峰数出现在3 416.19cm-1处，显示N-H伸缩振动，证明氢键的存在 。酰胺B波峰数出现在2 932.31cm-1处，表示CH2非对称性振动，是表述胶原蛋白与其它蛋白的特征。酰胺I波峰数出现在1 656.11cm-1处，表示C-O伸缩振动。 酰胺II波峰数出现在1 553.27cm-1处，表示C-N伸缩振动和N-H弯曲振动。所示结果与(J.H.Muyonga 2004)所报告的结果相似。

因为酰胺I出现在1 600～1 690 cm-1波数带，其对蛋白质二级结构变化敏感，吸收强大，酰胺I带为C=O伸缩振动及其与N-H弯曲振动、C-N伸缩振动的结合，酰胺I带和蛋白质的二级结构紧密相关，可敏锐反应胶原蛋白的二级结构的变化。

图3应用二阶导数谱结合去卷积和曲线拟合处理方法，定量计算出胶原蛋白的二级结构。并且利用已知结构的蛋白质对各个子峰进行归属，结果见表2。

表2 罗非鱼皮胶原蛋白二级导数拟合图谱Tab.2 Secondary derivatve fitting map of Tilapia skin collagen

在分离纯化鱼皮胶原蛋白的工艺过程中，由于溫度波動，化学试剂的影响会使胶原蛋白的三股肽链之间的氢键减弱，逐渐解螺旋，整个蛋白的无序结构增加[1]。归属分析所表征的鱼胶原二级结构证明鱼胶原和其它动物胶原一样由[α1]和[α2]肽链组成的三维螺旋结构，α、β螺旋，折叠及由3个氨基酸构成一个氢键闭合的螺旋环，并且未发现混乱结结构，证明合理的分离方法可以保持鱼皮胶原结构完整性。

2.5胶原蛋白的变性温度

由图4、图5可以看出，罗非鱼皮胶原ASC玻璃转化温度(Tg)为26.80 ℃，热溶解温度(Tm)为42.98 ℃；PSC玻璃转化温度(Tg)为28.20 ℃，热溶解温度(Tm)为42.21 ℃。鱼胶原蛋白的热变性温度多数低于30 ℃，(Senaratne 等, 2006)测定蟾鱼皮胶原热变性温度为28 ℃。(Kimura Ohno,1987)测定冷水性鱼如;阿拉斯加鳕鱼皮胶原热变性温度为16.8 ℃。而哺乳动物的猪皮胶原变性温度是37 ℃(Nagai 等, 2008)。也同样说明热变性温度与动物体温和环境温度有关。

图4 罗非鱼皮胶原蛋白ASC DSC实验结果Fig.4 DSC result of tilapia skin ASC (acid-soluble collagen)

图5 罗非鱼皮胶原蛋白PSC DSC实验结果Fig.5 DSC result of tilapia skin ASC (pepsine-soluble collagens)

2.6胶原蛋白的等电点

等电点图谱显示罗非鱼胶原PSC的等电点在6.8～7.01范围，ASC在6.9～7.03范围，ASC和PSC胶原等电点的变化估计是由于胃蛋白酶去除胶原端肽而引起的[14]。从胶原氨基酸的酸性和碱性情况分析，也可得出等电点应该呈弱酸性。

图6 胶原蛋白等电点图谱 Fig.6 Isoelectric point map of Tilapia skin collagen

2.7鱼胶原抗原性

用罗非鱼胶原诱导大鼠产生抗体，用酶联免疫分析计算得到大鼠血清中Ⅰ型胶原含量，结果见表3。

表3 酶联免疫法测大鼠血清中Ⅰ型胶原含量的结果Tab.3 Result of collagen content in rat serum by Elisa

大鼠1型胶原酶联免疫分析结果表明，用酶切除胶原蛋白端肽的酶溶性胶原(PSC)，在大鼠血清1型胶原的含量比酸溶性胶原低46.5%。证明胶原端肽是影响机体抗原的重要因素。表3的结果也显示鱼胶原比牛胶原具有更低的抗原性。

2.8电镜分析

鱼皮胶原蛋白扫描电镜如图7所示。

图7 鱼皮胶原蛋白扫描电镜照片Fig.7 SEM picture of Tilapia skin collagen

图7所显示的4幅扫描电镜图分别为2万，5万和10万倍，右上角图清楚显示胶原纤维的明暗交替排列，首尾相随，平行排列。胶原分子为右手螺旋，3股肽链为左螺旋[15]，左上角图呈现不同层胶原纤维的排列方向。

3 结论

本文从罗非鱼皮中经过严格的提取和纯化工艺，获得了高纯度胶原蛋白样品，这为制备医用级水平的生物医用材料奠定了十分重要的工艺基础。该产品再通过上述全面的表征，进一步了解和掌握了罗非鱼皮胶原蛋白作为人体临床用的医疗产品所必需具备的特性。现简单归总如下：

(1)罗非鱼鱼皮胶原蛋白是I型胶原类型，表征的结果显示未见与其它类型胶原之共存。

(2)形成胶原蛋白3股肽链之间稳定的螺旋结构主要的作用力是氢键，由于羟脯氨酸的羟基参与肽链间氢键的形成，所以亚基氨基酸的含量影响胶原纤维的强度，水生动物的亚基氨基酸含量低于陆生动物，水生动物的热变性温度也要低于陆生动物。

(3) 影响动物亚基氨基酸的主要因素是动物的体温与动物生长的环境温度。水生动物不仅种类多样性，而且生活环境多样性，所以，暖水性鱼和冷水性鱼的亚基氨基酸也有较大差异。这就提示我们，在选择水生动物来源十分重要，且后需进一步提升其玻璃化转化温度，接近与人体。

(4)鱼胶原是能够满足生物医用材料所要求的各项技术要求，在纯度、杂蛋白含量、羟脯氨酸含量与氨基酸成分等方面度均能达到或超过相关技术指标，并且在抗原性和安全性方面均优于牛和猪胶原。作为一种新的优良的医用生物胶原材料，鱼胶原蛋白确实值得大家重视与开发。

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ExtractingandCharacterizingMedicalGradedCollagenBasedBiomaterialUsingTilapiaMossambicaFishSkin

Wang Nanping, He Lan, Guo Xiuyu, Gu Qisheng

Shanghai Fisheries Research Institute Aquatic Prodncts Processing Lab(Shanghai,200433)

ObjectiveExtract medical grade collagen from Tilapia Mossambica fish skin for human clinical use.MethodsHigh purified collagens were obtained from Tilapia Mossambica fish skin through extraction fractionation and purification. SDS-PAGE, FI-IR, ELASA and Electrical Microscopy were used to characterize the extracted collagens.ResultsCollagen extracted from Tilapia Mossambica are type I collagen with purity being higher than 95%. The collagen contains 10.09% hydroxyproline and 98.47% collagen.Results show that antigenicity of the collagen is lower than bovine based collagen. Its glass transition point is at 26-28 ℃ and melting point 42 ℃, respectively.ConclusionFrom the testing results, it can be concluded that collagen extracted from Tilapia Mossambica fish skin meets the requirements of medical grade biomaterial. Collagen based material can be used in human clinical as bleed stop and repair material.

collagen, medical materials, remediation

10.3969/j.issn.1674-1242.2014.03.005

上海市科技兴农重点攻关项目沪农科攻字(2012)

第 4-4 号

王南平，教授级高工，主要从事水产品精深加工研究，E-mail：yujiash@hotmail.com

R318.08

A

1674-1242(2014)03-0146-06

2014-06-23)