五味子中残留农药对卵巢颗粒细胞的毒性研究

姜丹丹，朗 朗，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076；2.国家教育部 抗肿瘤药物工程研究中心，哈尔滨150076)

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill 的干燥成熟果实.主产于黑龙江、辽宁、吉林、河北等地.其性酸、甘、温，归肺、心、肾经，具有敛肺生津、补肾养心、收敛固涩之功效，主治久嗽虚喘、梦遗滑精、心悸失眠等[1]，是常用中药 .但由于在种植保存过程中施用大量农药，造成农药残留，对中药的开发利用产生限制，有研究人员针对不同地区的不同种类的中草药进行测定，发现均有不同程度的农药残留，对人体健康存在着潜在危害[2-4].

颗粒细胞是组成成熟卵泡的最大细胞群，为卵母细胞的生长提供营养物质，维持有利于卵母细胞生长和成熟的微环境[5]，并且是雌激素和孕激素的主要来源，只有颗粒细胞正常发育，才能保证卵母细胞成熟、卵泡发育.因此本实验选择颗粒细胞作为残留农药毒性研究的靶细胞，希望通过MTT和Western blot法对残留农药的生殖毒性及其机制进行研究，进而明晰残留农药的生殖危害，同时也为中药种植中农药的使用提供警示.

1 实验材料

1.1 动物

2周龄SPF级雌性小鼠，由哈尔滨兽医研究所提供.(生产许可证号：SYXK黑2008001)

1.2 药物

中药材样品来源于大庆市让湖路区银浪江业中药材种植合作社.实验通过超声萃取的方法从五味子中提取出残留农药.

1.3 主要仪器和试剂

CO2培养箱CO-150型(美国新布朗什维克科学公司)；超净工作台DL-CJ-1N医用型(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；Anke TDL 80-2 B离心机(上海安亭科学仪器厂)；Model 680 酶标仪(美国Bio-Rad公司)；高速低温离心机(美国Beckman-Coulter公司)；电泳仪、垂直电泳转印槽(Bio-Rad公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；雌二醇(大连美仑生物技术公司)；兔抗ERK、p-ERK多克隆抗体、碱磷酶标记羊抗兔IgG(北京中杉金桥)；兔抗Actin多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；Western及IP细胞裂解液、碱磷酶显色试剂盒(碧云天公司).

2 实验方法

2.1 卵巢颗粒细胞的分离

取洁净级的雌性小鼠，腹腔注射孕马血清30 u/只，24 h后颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒.“V”字形切口剪开腹部皮肤，取出双侧卵巢，放入预冷的PBS中，去除其周围的脂肪组织及表面包膜，放入新的PBS的培养皿中反复冲洗.将所有卵巢小心移入无菌的10 mL离心管中，加10倍于卵巢体积的0.2%胰蛋白酶- 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)混合液，于37 ℃水浴消化30～50 min，期间从水浴锅中取出用力振荡2～3次，直至卵巢消化为絮状悬浮，颗粒细胞团块分离为止.加入同等体积含有15%胎牛血清的培养液终止消化.1 000 r/min离心5 min，弃上清.收集的细胞加入5 mL含15%胎牛血清、5%青链霉素的DMEM培养基于玻璃培养瓶中，放入培养箱(5% CO2，37 ℃)中培养.

2.2 MTT法检测卵巢颗粒细胞活力

实验所分离提取的卵巢颗粒细胞，经细胞计数板计数后，加入适量的含15%血清及100 u/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基稀释至5×104个/mL，然后按每孔5 000个接种于96孔板内，放入含5% CO2的37 ℃培养箱中培养.细胞培养48 h后每孔给药100 μL，继续培养24、48、72 h后，吸净每孔内残留的药液，加入MTT培养2.5～4 h，吸净MTT液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲簪沉淀，振荡10 min，用酶标仪检测各孔的光密度值(OD值).用下面公式计算作用物质的细胞增殖率：

(1)

实验分组：1)阴性对照组(体积分数0.1%正己烷)作用24、48、72 h；2)农药提取物(pesticide extract)作用24、48、72 h；3)阳性对照组(17β- E2)作用24、48、72 h，给药浓度为1×10-8mol/L.

2.3 Western blot实验检测农药提取物对卵巢颗粒细胞ERK，p-ERK蛋白表达水平的影响

提取分离的颗粒细胞，每瓶加入80 μL的细胞裂解液，于冰上裂解30 min，收集细胞至 EP 管.放入离心机 4 ℃、12 000 r /min，离心 10 min，取上清，根据蛋白含量测定上样量.12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将胶中的蛋白通过电转槽转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，TBST 缓冲液振荡洗涤3次，每次10 min，分别加入ERK，p-ERK过夜(4 ℃) ，TBST 缓冲液振荡洗涤，加入碱磷酶标记山羊抗兔IgG室温孵育2 h，经TBST 缓冲液振荡洗涤后，用碱性磷酸酶显色缓冲液室温避光显色，Tannon凝胶成像系统照相.扫描图像在天能GIS凝胶成像分析系统进行量化分析.

3 统计学处理

蛋白相对密度(Relative Density)

(2)

4 实验结果

4.1 MTT法比较农药提取物对卵巢颗粒细胞作用24、48、72 h增殖率的影响

结果发现农药提取物作用24、48、72 h均可促进卵巢颗粒细胞增殖(见图1).其中农药提取物作用48 h卵巢颗粒细胞增殖率为124.8%，其结果与阴性对照组比较差异极显著(P<0.01).农药提取物作用卵巢颗粒细胞24 h和72 h增殖率分别为117.7%、114.6%与阴性对照组比较有显著性(P<0.05).

图1 农药提取物对卵巢颗粒细胞增殖率的影响注：与阴性对照组比较 *P<0.05 **P<0.01

4.2 Western Blot法检测农药提取物对卵巢颗粒细胞中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平的影响

Western Blot法检测农药提取物及阳性对照E2作用卵巢颗粒细胞48 h后ERK1/2蛋白表达水平的改变，结果如图2所示，内参蛋白β-actin条带灰度基本一致，阴性对照组正己烷表达率为(51.0±2.22)%，(54.3±2.12)%， 阳性药E2组表达率为(70.7±1.78)%，(72.5±2.89)%，农药提取物组 (90.2±2)%，(92.6±2.44)%.由此可见农药提取物可以显著促进小鼠卵巢颗粒细胞内ERK1/2蛋白表达(P<0.01).阴性对照组p-ERK1/2蛋白表达率为(40.4±2.0)%，(41.9±2.22)%， E2组(67.9±2.67)%，(71.0±1.78)%，提取物组 (95.2±3.30)%，(99.1±1.66)%，由此可见农药提取物组会显著促进p-ERK1/2蛋白表达，与阴性对照相比差异极显著(P<0.01).

图2 农药提取物和对卵巢颗粒细胞中ERK1/2及 p- ERK1/2蛋白表达的影响

5 讨 论

细胞外信号调节激酶(ERK)是MAPK信号传导通路中最具有代表性、研究最透彻的途径之一，其为Raf-MEK-ERK途径[6].ERK1/2受到细胞外的刺激而活化，激活ERK的标志是 ERK 活化成p-ERK，然后p-ERK激活转录因子和一些丝氨酸/苏氨酸激酶，并且具有特异性.激活的ERK主要是抑制细胞凋亡，并促进细胞增殖和分化，从而调节细胞周期和维持细胞存活[7-9].

农药提取物在诱导卵巢颗粒细胞增殖过程中，ERK1/2通路处于激活状态，同时促进卵巢颗粒细胞中磷酸化ERK1/2的表达.该结果说明，ERK1/2激活是提取物促进卵巢颗粒细胞增殖的分子机制之一.提示残留农药促进卵巢颗粒细胞的增殖作用与ERK途径有关，而ERK1/2蛋白在防止分化和维持生殖细胞增殖潜能中起着重要作用，因此推断残留农药对颗粒细胞的增殖具有维持作用.细胞内许多信号通路均能激活ERK通路，使ERK蛋白磷酸化，因此对于残留农药ERK的激活还需进一步研究.

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中国药典一部[M].北京: 人民卫生出版社, 2005: 44 -5.

[2] 薛 健, 郝丽丽, 彭 非, 等. 55种中药材的有机氯农药残留状况调查报告[J].世界科学技术-中医药现代化, 2008, 10(3): 62-65.

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[5] 崔 娜, 郝桂敏, 赵志明, 等. 颗粒细胞凋亡及线粒体膜电位与卵巢功能的相关性研究[J]. 河北医药, 2011, 33(6): 818-820.

[6] 陆 嵘, 房静远. ERK-MAPK信号传导途径抑制剂治疗结肠癌的研究现状[J]. 国外医学：消化系疾病分册, 2005, 25(6): 354-357.

[7] HOSHINO R, TANIMURA S, WATANBE K,etal. Blockade of the extracellular signal-regulated kinase pathway induces marked Glcell arrest and apoptosis in tumor cells in which the pathway is constitutively activated: up-regulation of p27 [J].The Journal of Biological Chemistry, 2001, 26(2): 2686-2688.

[8] 赵 艳, 吴 坤. 哺乳动物细胞中MAPK信号转导途径的研究进展[J]. 国外医学：卫生学分册, 2004, 31(1): 16-21.

[9] 许方雪，郎 朗，季宇彬.海产食品中农药残留的毒性研究[J]. 哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2014，30(2)：186-189.