鲍氏不动杆菌在鼻咽癌放疗医院感染中的同源性分析

李传杰 （梧州市红十字会医院感染科，广西 梧州 543002）

陶建萍 （梧州市红十字会医院微生物室，广西 梧州 533000）

李军 （梧州市红十字会医院分子微生物室，广西 梧州 543002）

高建全，梁锦辉 （梧州市红十字会医院放疗科，广西 梧州 54300）

鲍氏不动杆菌 （AB）是鼻咽癌放射医院感染的重要病原菌，准确的种属鉴定和基因分型对预防和控制感染非常重要［1－3］。为了解鼻咽癌放疗AB医院感染的同源性，本研究采用随机扩增多态性（RAPD）技术对鼻咽癌住院放疗患者临床分离的AB进行基因分型同源性分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 AB分离株来源于2013年1月至12月本院4个放疗病区鼻咽癌住院放疗医院感染的临床标本。其中男40例，年龄20～71岁，平均50岁；女3例，年龄48～61岁，平均50岁。每位患者均发生不同程度医院感染，其中有10株分离自4例病人在不同住院时间的相同部位。

1.1.2 仪器和试剂 BD phoenix 100全自动微生物鉴定药敏系统；ABI 9700PCR仪，DYY－6C型电泳仪 （北京六一仪器厂），Centrifuge 5415D离心机 （Eppendorf公司），凝胶成像系统 （Kodark Elctrophoresis Documentation and Analysis System 120＋），ABI 3900DNA合成仪；DNA提取试剂QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit（Qiagen公司），Taq PCR （Qiagen公司），引物 （英潍捷基公司）。

1.2 方法

1.2.1 鉴定和药敏 采用BD phoenix 100全自动微生物鉴定药敏系统对临床分离菌株进行鉴定和药敏实验，参照CLSI M100－S23推荐的抗菌药物药敏试验分组原则选择7类14种代表性药物进行耐药性分析。

1.2.2 RAPD操作 应用RAPD技术对临床分离菌进行分子生物学基因分型［4－5］，引物序列为：ABFR1：GCTTGTGAAC。DNA提取：将菌液1.5ml置于Eppendorf管经多次孵育、振荡、离心，提取DNA溶液备用。反应条件：93℃2min；92℃30s，40℃1min，72℃3min，34Cycles；92℃30s；40℃1min；72℃10min。产物检测：取扩增产物5μl与1μl Loading buffer充分混匀，于2%琼脂糖凝胶、170V电压电泳40min；使用紫外线凝胶成像系统观察、照相。

1.2.3 基因分型 用Cross Checker软件对条带进行识别，自动识别错误的条带用手工识别调整，形成NTS文件。将NTS文件导入NTSYSpc 2.0软件模拟计算遗传距离，选择 “SAHN”功能做聚类分析，生成亲缘关系树状图。DNA基因型别同源性判断以每一分离物的所有可见带具有相同的移动距离定为同一型 ，带的形状移动的距离不同或所有可见带的移动距离相同但缺少两条带以上定为另一型。各个菌株的扩增电泳条带数目和移动完全相同者，表示这些菌株之间高度同源。

2 结果

2.1 临床分布

37例感染患者临床标本分离出43株AB，其中咽拭子24株 （55.81%）、痰13株 （30.23%）、口腔分泌物5株 （11.63%）、血液1株 （2.33%），临床分布为放疗一区5株 （11.63%）、二区20株（46.51%）、三区7株 （16.28%）、四区11株 （25.58%）。

2.2 耐药性

43株AB对14种代表性抗菌药物全部敏感占13.95%，单独哌拉西林耐药占9.30%，单独庆大霉素耐药占4.65%，泛耐药占18.60%，其中：氨苄西林／舒巴坦耐药率30.23%、哌拉西林62.09%、哌拉西林／他唑巴坦34.88%、头孢他啶32.56%、头孢曲松60.47%、头孢吡肟37.21%、亚胺培南18.60%、美罗培南18.60%、庆大霉素29.53%、阿米卡星20.83%、环丙沙星27.91%、左氧氟沙星25.58%、四环素34.92%、复方新诺明32.56%。

2.3 基因型别

43份AB样本扩增电泳出38个图谱，分16个基因型别，其中I型17株占44.74% （8、11、12、15、16、19、21、23、24、25、29、31、34、37、38、39、40号样本），A型4株（1、2、18、20号样本），E型2株 （6、35号样本），G型2株 （9、10样本），H 型2株（13、30号样本）；其他型别各1株；未扩增出条带5株 （22、26、27、36、42号样本）。

2.4 同源性分析

不同型别分离菌在各病区散在分布，I型分离菌主要分离自咽拭子标本 （39.53%），75.0%的泛耐药株同为I型，单独庆大霉素耐药AB（2株）同为A型，见图1、表1。相同病人在不同时期感染分离株的型别无密切亲缘关系。

图1 16个不同型别AB亲缘关系树状图

3 讨论

放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，也是诱发鼻咽癌AB医院感染的高危因素。我市及周边地区是世界鼻咽癌高发区，放疗相关医院感染率高达79.33%［1］。多重耐药的AB几乎对所有头孢菌素、氨曲南、氨基糖苷类、喹诺酮类药物均高度耐药［6］，而且容易在不同病区、不同感染个体、感染部位之间交叉感染传播，临床治疗和防控十分棘手［7－8］。准确的种属鉴定和基因分型对感染源和传播途径的追踪、耐药菌监测、感染的诊断和治疗有较好的指导作用［3，5，9］。

本组资料中AB在咽拭子、口腔分泌物等口咽部感染标本的构成比高达67.44%，与罗晋卿、张锦林等文献报道基本一致［1，10］。对7类14种代表性抗菌药物的耐药率除哌拉西林和庆大霉素外都低于40%，说明我院近期在临床治疗鼻咽癌AB感染时的抗菌药物选择压力尚可。RAPD基因分型结果显示：不同型别感染菌的病区分布散在，75%的泛耐药株均同属于Ⅰ型，揭示耐药的出现应与患者本身疾病严重程度、放疗强度以及抗菌药物使用等因素有关，但不排除耐药菌病区之间交叉传播的可能性。高耐药的Ⅰ型在咽拭子标本的高分布 （39.53%）可能与鼻咽癌患者的口咽部放疗损伤和泛耐药感染菌的难治性等相关。相同病人在不同时期多次感染分离株无密切亲缘关系，提示病区环境广泛存在的AB可在鼻咽癌放疗后抗感染能力下降的情况下反复，条件致病。

表1 38株不同型别AB临床分布

研究结果表明，本组资料AB对多种抗菌药物保持较好敏感性，临床治疗鼻咽癌AB感染时的抗菌药物选择压力不大。同型别菌株的耐药表型相近，但单独泛耐药表型及单一抗菌药物耐药表型的菌株之间基因同型不能确定交叉感染的存在。不同感染部位标本分离株之间同源性不明显，抗感染能力低下的鼻咽癌放疗患者容易反复感染同种非同源的AB。合理运用RAPD基因分型技术开展鼻咽癌放疗等医院感染危险因素及感染菌同源性研究，对强化和改进感染防控措施，减少耐药菌的产生和播散十分重要。

［1］罗晋卿，蔡永林，钟伟铭，等 .鼻咽癌患者放射治疗中发生医院感染的危险因素研究 ［J］.中国全科医学，2012，15（16）：1839－1843.

［2］彭建忠，詹燏 .肿瘤患者医院感染的病原菌分布及危险因素分析 ［J］.中华医院感染学杂志，2012，22（4）：715－716.

［3］刘丹，王培昌，赵霞，等.RAPD、ERIC－PCR联合REP－PCR对多重耐药鲍曼不动杆菌基因型的鉴定 ［J］.山东医药，2010，50 （40）：99－100.

［4］Azfer A，Bashamboo A，Ahmed N，et al.Random amplification of polymorphic DNA with conserved sequences reveals genome specific monomorphic amplicons：Implications in cald Identifiction ［J］.J Biosci，1999，24 （1）：35－41.

［5］李传杰，罗晋卿 .医院感染同源性基因分型研究进展 ［J］.检验医学与临床，2013（20）：2767－2769.

［6］李丹，吴安华，冯丽，等 .重症监护室患者与环境分离的多重耐药不动杆菌属细菌同源性研究 ［J］.中国感染控制杂志，2008，7 （5）：306－309.

［7］杜明梅，邢玉斌，索继江，等 .多重耐药菌医院感染的实时监测与预防控制 ［J］.中国医院，2013（3）：3－5.

［8］Pere ZF，Hujer AM，Hujer K，et al.Global challenge of multidrug－resistant acinetobacter baumannii［J］.Amimicrob Agents chemother，2007，51（10）：3471－3484.

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［10］张锦林，倪美鑫，季屹红，等 .肿瘤专科医院恶性肿瘤患者医院感染的调查分析 ［J］.中华医院感染学杂志，2011，21（7）：1334－1336 .