Nesfatin-1对大鼠胃粘膜胃酸和胃蛋白酶分泌机制的研究

刘锦宙，杨燕，李学良

（1.江西省宜春市人民医院消化内科，江西宜春336000；2.江西省宜春职业技术学院，江西宜春336000；3.南京医科大学医学科学部，江苏南京210029）

Nesfatin-1对大鼠胃粘膜胃酸和胃蛋白酶分泌机制的研究

刘锦宙1，杨燕2，李学良3

（1.江西省宜春市人民医院消化内科，江西宜春336000；2.江西省宜春职业技术学院，江西宜春336000；3.南京医科大学医学科学部，江苏南京210029）

目的观察Nesfatin-1对大鼠的胃蛋白酶和胃粘膜胃酸分泌的影响，并探究影响分泌的作用机制。方法18只成功侧脑室置管雄性SD大鼠，分为高剂量组、低剂量组和对照组，分别在侧脑室注射Nesfatin-1（0.05μg／只）、（0.5μg／只）及等体积的灭菌水（5μL／只）。采用幽门结扎法收集胃液，3 h后处死大鼠，测定其胃酸和胃蛋白酶的变化，并用RT-PCR法检测胃组织中H＋-K＋-ATP酶的表达量，用Western blot检测胃黏膜中组胺酸脱羧酶（histidine decarboxylase，HDC）蛋白的表达水平，ELISA法检测胃体黏膜中组胺的含量。结果大鼠注射Nesfatin-1 3 h后，与注射等体积的灭菌水的对照组相比，大鼠胃酸和胃蛋白酶的分泌量分泌量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。且给药的2组之间胃蛋白酶分泌量差异有统计学意义（P＜0.05）。大鼠胃粘膜中的组胺分泌下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，给药后，2组大鼠胃H＋-K＋-ATP酶mRNA表达量明显下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。同时HDC蛋白在高剂量组和低剂量组大鼠胃粘膜中的表达显著下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论侧脑室注射Nesfatin-1，可以明显抑制大鼠胃酸和胃蛋白酶的分泌，其作用机制可能是通过影响中枢神经、H＋-K＋-ATP酶mRNA的表达量、组胺合成通路中关键酶的表达抑制胃酸分泌。

侧脑室注射；大鼠；胃酸；胃蛋白酶

Nesfatin-1是由日本学者发现的一种来源于核组蛋白2（nuclear histone 2，NMCB 2）的新厌食肽［1］，其表达于多种组织中。中枢神经系统中，在调节代谢和摄食的下丘脑和脑干中的部分神经核团细胞中nesfatin-1呈现阳性表达，包括下丘脑室旁核、弓状核、孤束核和动眼神经副核［2-3］等。外周组织，十二指肠、胰岛、睾丸、以及胃粘膜内分泌细胞中有部分细胞阳性表达nesfatin-1［4-5］。其中以胃肠道细胞中nesfatin-1表达程度最强。对于nesfatin-1抑制摄食的作用，研究发现是通过非依赖于瘦素的机制，也可能作用于MC3／MC4-CRF2的通路［6］以及催产素通路［7］发挥抑制摄食作用。目前研究发现中枢注射nesfatin-1可以明显抑制大鼠胃酸分泌，分析表明nesfatin-1参与了调节胃黏膜酸分泌［8］，但其作用机制的研究文献报道较少，本研究通过将nesfatin-1注射到侧脑室，研究nesfatin-1对大鼠胃酸和胃蛋白酶的作用，并同时观察胃组织中H＋-K＋-ATPase的表达、胃粘膜组织中组氨酸脱酸酶的表达以及组胺表达水平的变化，来探究nesfatin-1影响胃蛋白酶和胃酸分泌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，体质量200～240 g，动物购自安徽医科大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK（皖）2012-002。动物饲养条件：温度22℃左右，动物自由饮食饮水，动物室保持自然光暗周期。

1.2 主要试剂与仪器 Nesfatin-1（Phoneix Pharmaceuticals公司）；小鼠抗大鼠单克隆H＋-K＋-ATPase beta抗体（Abcam公司）；BCA蛋白测定试剂盒（Invitrogen公司）；HDC和Actin引物（上海生博生物医药科技有限公司）；抗HDC抗体（Abcam公司）；抗Actin（Bioword公司）；胃蛋白酶检测试剂盒（上海绿叶生物技术有限公司）。Trizol试剂（Invitrogen公司）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；大鼠脑立体定位仪、套管芯和套管、开脑颅钻（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；微量注射器（上海关正医疗仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠侧脑室置管：水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后将大鼠固定于脑立体定位仪，用颅钻在右侧大脑开洞，把套管置进右侧脑室，用胶水将套管固定在颅骨上。置管后大鼠恢复7天，待实验结束后用注射器通过套管往大脑中注入美蓝溶液，将脑组织取出，规定大鼠脑室内壁如都染有美蓝颜色的大鼠所得到的实验数据是有效实验数据。

1.3.2 分组及给药：将置管成功的大鼠分为3组，每组大鼠6只，分别为高剂量组、低剂量组和对照组，所注射的药物及计量依次为：nesfatin-1 0.5 g／只、nesfatin-1 0.05 g／只、灭菌水5 μL／只。在给药3小时后将各组大鼠处死，收集胃液和胃组织，并将为组织保存于液氮中。

1.3.3 胃酸的测定：用酸碱滴定法检测胃酸的分泌量。将从3组大鼠胃中收集的胃液1m L置于烧杯中，滴加两滴酚酞指示剂，用精确浓度的NaOH滴定，边滴加NaOH边晃动烧杯，待酚酞指示剂颜色消失时记录NaOH的消耗量，通过计算得出胃酸的浓度，再用胃酸浓度与所收集的胃液量相乘，所的到的乘积即为胃酸的分泌量。

1.3.4 胃蛋白酶的测定：取鸡蛋清，并打匀蛋清，过滤，然后再取毛细玻璃管，用打匀过滤后的蛋清将毛细玻璃管灌满，再将灌满的毛细玻璃管用85℃热水将管中的蛋清凝固，保存于冰箱中备后用。分别将1mL所收集的各组大鼠胃液置于烧瓶中，加入15mL的0.05mol／L的盐酸，再将先前制备的凝固后的蛋清毛细玻璃管两根放入烧瓶中，封口烧瓶，将烧瓶放入37℃的恒温箱中孵育24 h，孵育后将蛋白管取出，测量毛细玻璃管两端透明的长度，再求出这四透明端长度的平均值L。

大鼠胃蛋白酶活性单位＝L2×16，大鼠胃蛋白酶排出量＝大鼠胃蛋白酶活性单位×胃液量／5［10］。

1.3.5 RT-PCR检测H＋-K＋-ATP酶mRNA的表达量：提取3组大鼠胃粘膜中总的mRNA，再通过逆转录生成为为cDNA，最后进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性95℃5 min，变性95℃，45 s，退火56℃，30 s，延伸72℃，30 s，共32个循环；终末延伸72℃，10 min。H＋-K＋-ATP酶上下游引物：上游引物5′-CTCTGCTTTGCGGGACTT-3′；下游引物5′-CCTTGGCTGTGATGGGAT-3′，以Actin为内参照。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，观察、拍照。

1.3.6 Western blot检测HDC蛋白表达：裂解3组大鼠的胃粘膜组织，提取胃粘膜组织中的总蛋白。再用BCA法对所提取的总蛋白进行定量。每孔上样20μL体积的蛋白上清液与蛋白上样缓冲液的混合液，再在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，待目的蛋白充分分离后将目的蛋白转移到聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）；5%脱脂奶粉封闭2 h；PBST反复洗膜3次，10min／次；加入一抗，分别为抗HDC抗体和抗Actin抗体，在4℃冰箱中过夜孵育；在二抗中常温孵育1 h；用ECL化学发光试剂显影，的位置涂布ECL，在暗室中曝光成像到胶片中；扫描分析。

1.3.7 ELISA法检测胃黏膜中组胺的表达量：参照ELISA试剂盒使用说明检测各组大鼠胃粘膜中组胺的表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行实验数据分析，正态计量数据用±s”表示，正态资料组间比较采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nesfatin-1侧脑室注射对大鼠胃酸和胃蛋白酶分泌的影响 与对照组相比，高剂量组和低剂量组大鼠给药3 h后胃液中的胃酸含量和胃蛋白酶的分泌量减少，高剂量组与低剂量组和对照组的比较差异均有统计学意义（P＜0.01，见表1）。高剂量组与低剂量组2组胃酸分泌量相比，差异无统计学意义。高剂量组胃蛋白酶分泌量少于低剂量组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR检测H＋-K＋-ATP酶mRNA的表达量 与对照组相比，结果显示给药的2组大鼠胃H＋-K＋-ATP酶mRNA表达量明显下调，差异有统计学意义（P＜0.01，见图1）。但给药组之间差异没有统计学意义。

图1 Nesfatin-1侧脑室注射对大鼠胃H＋-K＋-ATP酶mRNA表达的影响1.正常对照组；2.给药组（0.05 g／只）；3.给药组（0.5 g／只）＃P＜0.05，与正常对照组比较Fig.1 Effect of nesfatin-1 on rats gastric H＋-K＋-ATPasemRNA expression1.Control group；2.Dose group（0.05 g／rat）；3.Dose group（0.5 g／rat）＃P＜0.05，compared with control group

2.3 Western blot检测HDC蛋白表达 大鼠侧脑室注射nesfatin-1（0.05 g／只及0.5 g／只）后，采用Western blot检测HDC蛋白表达情况。与对照组相比，结果显示给药的2组大鼠在3 h后胃粘膜中的HDC蛋白表达明显下降，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。但给药组之间无差异性，无统计学意义。说明随着大鼠侧脑注射nesfatin-1剂量的增加，胃粘膜中的HDC蛋白表达并不呈现剂量依赖性下降。具体结果见图2。

图2 Nesfatin-1侧脑室注射对大鼠胃黏膜HDC蛋白表达的影响（n＝6）1.正常对照组；2.给药组（0.05 g／只）；3.给药组（0.5 g／只）Tab.2 Effect of nesfatin-1on protein expression of HDC（n＝6）1.Control group；2.Dose group（0.05 g／rat）；3.Dose group（0.5 g／rat）＃P＜0.05，与对照组比较，compared with control group

2.4 Nesfatin-1对大鼠胃黏膜中组胺含量的影响 大鼠侧脑室注射nesfatin-1（0.05 g／只及0.5 g／只）3 h后，给药的2组大鼠胃粘膜中的组胺分泌下降，高剂量组与低剂量组和对照组的比较差异有统计学意义（P＜0.05）。且给药组之间也存在差异性，即高剂量组大鼠胃粘膜中组胺的分泌量明显少于低剂量组，具有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表3 Nesfatin-1对大鼠胃黏膜中组胺含量的影响（n＝6）Tab.3 Effect of nesfatin-1on the expression of histamine in gastric mucosa（n＝6）

3 讨论

Nesfatin-1是日本学者发现的一种新的厌食肽，包含82个氨基酸，起源于核组蛋白2（NMCB 2）。NΜCB2在激素原转化酶的作用下水解为N-端片段nesfatin-1和2个C-端肽Nesfatin-2和Nesfatin-3。但只有nesfatin-1能够抑制大鼠的摄食量和体重的增加。Nesfatin-1表达于下丘脑弓状核、室旁核、脑干的迷走神经背核、孤束核以及胃、胰腺、十二指肠等外周组织中。Nesfatin-1可以调节多种生理活动，包括抑制摄食、能量调节、胃肠运动和胃粘膜的保护作用［2］等。研究发现：nesfatin-1主要与胃泌酸腺的中间部分的X／A样细胞分泌的ghrelin共存，nesfatin-1还在泌酸腺基底部的少数细胞中与生长抑素和组氨酸脱羧酶共存［11］。提示nesfatin-1在胃粘膜的分泌功能中起着重要作用。

多种激素和中枢神经相互协调调节胃酸分泌。调节胃酸分泌的主要神经核团有孤束核、下丘脑以及迷走神经运动背核，迷走神经运动背核是胃酸分泌的主要中枢调节冲动来源，这部分的中枢神经冲动经过迷走神经先将神经冲动传导至胃壁肠神经系，再通过肠神经系将神经冲动传导至胃腺迷走神经运动背核，对来自于孤束核的内脏感觉传入和下丘脑的中枢感觉传入进行系统的整合，进而调节胃酸分泌［12］。

外周调节胃酸分泌主要通过食物进入而导致胃的一系列的变化，包括胃胃肠蠕动、机械扩张胃体和食糜入肠激活肠的内分泌系统进而调节胃酸分泌。外周调节胃酸的分泌主要通过调节多种物质的分泌来实现，这些物质主要有胃泌素、组胺和乙酰胆碱，这3种主要泌酸因子可分别与相应的受体结合，通过其下游信号通路，刺激胃酸分泌［13］。本研究显示，大鼠侧脑注射nesfatin-1后，不仅可以降低胃酸和胃蛋白酶的分泌量，同时可以抑制胃粘膜中组胺合成的关键酶组氨脱羧酶的基因和蛋白的表达，通过这一抑制作用，影响组胺的合成，导致大鼠胃粘膜中的组胺量降低。实验结果提示，nesfatin-1通过对组氨脱酸酶的抑制，影响组胺的合成及释放，可能产生抑制胃酸和胃蛋白酶的作用。其是通过直接抑制组胺合成还是减少胃泌素的合成间接抑制组胺的合成，需要进一步深入研究。

胃酸分泌的关键酶之一是H＋-K＋-ATP酶，该酶通过自身去磷酸化和磷酸化，将细胞外液中的K＋主动运入至细胞内，同时将细胞内的H＋泵出细胞外，实现H＋／K＋跨膜转运以及胃酸的分泌。国外研究表明H＋-K＋-ATP酶的表达变化与胃酸分泌能力一致，国内也证实这种情况［14］。因此本研究选取测定该酶的表达情况来反映胃蛋白酶和胃酸的分泌情况。结果显示，大鼠注射nesfatin-1后，大鼠胃中H＋-K＋-ATP酶的表达出现明显下降，胃酸分泌能力也随之降低。提示大鼠侧脑室注射nesfatin-1，通过降低H＋-K＋-ATP酶的表达，从而发挥抑制胃酸分泌的能力。

如上所述，胃酸分泌调节是一个复杂的过程，涉及的神经系统和重要的调节因子较多。最新研究表明nesfatin-1很可能通过激活迷走神经进而使得胃酸的分泌得到抑制，但这个抑制过程是通过直接作用于壁细胞，还是通过间接作用于胃黏膜其他细胞，抑或通过作用于何种受体，目前尚未清楚，还深入研究［15-16］。但总的来说，大鼠侧脑室注射nesfatin-1，可以抑制大鼠胃粘膜中胃酸和胃蛋白酶的分泌，并可以降低胃中H＋-K＋-ATP酶的表达、组胺合成关键酶组氨脱羧酶的表达以及组胺的含量。其机制可能与中枢系统、H＋-K＋-ATP酶的表达以及影响组胺合成途径有关。

［1］ Oh-IS，Shimizu H，Satoh T，et al.，Identification of Nesfatin-1 as a satietymolecule in the hypothalamus［J］.Nature，2006，443（7）：709-712.

［2］ 何虹，张林，胡茂清.Nesfatin-1的研究进展［J］.中国中西医结合消化杂志，2013，21（9）：499-452.

［3］Kohno D，Nakata M，Maejima Y，et al.，Nesfatin-1 neurons in paraventricular and supraoptic nuclei of the rat hypothalamus coexpress oxytocin and vasopressin and are activated by refeeding［J］. Endocrinology，2008，149（9）：1295-1301.

［4］ 张爱青，李学良.Nesfatin-1在人及啮齿类动物消化系统的表达［J］.中华消化杂志，2011，31（2）：112-116.

［5］Zhang AQ，Li XL，Jiang CY，et al.，.Expression of Nesfatin-1／NUCB2 in rodent digestive system［J］.World JGastroenterol，2010，16（6）：1735-1741.

［6］Yosten GL，Samson WK.Nesfatin-1 exerts cardiovascular actions in brain：possible interaction with the central melanocortin system［J］. Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297（2）：R330-6.

［7］Maejima，Y.Nesfatin-1-regulated oxytocinergic signaling in the paraventricular nucleus causes anorexia through a leptin-independent melanocortinpathway［J］.Cell Metab，2009，10（5）：355-65.

［8］ 李静慧，李学良，吴静，等.Nesfatin-1对离体胃黏膜细胞胃酸分泌的影响［J］.世界华人消化杂志，2012，20（13）：1123-1130.

［9］ 吴静，贾方圆，谢碧云，等.侧脑室注射Nesfatin-1抑制大鼠胃酸分泌［J］.基础医学与临床，2013，33（5）：552-554.

［10］徐叔云.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2000：1，141.

［11］Aydin，S.Time-dependent changes in the serum levels of prolactin，Nesfatin-1 and ghrelin as a marker of epileptic attacks young male patients［J］.Peptides，2011，32（6）：1276-1280.

［12］Browing KN，Travagli RA.Plasticity of vagal brainstemcircutis in the control of gastric function［J］.NeurogastroenterolMotil，2010，22（8）：1154-1163.

［13］Chen D，Zhao C.Complexity of gastric acid secre tion revealed by targeted gene disruption in mice［J］.Curr Pharm Design，2010，16（11）：1235-1240.

［14］沙杰，李学良，朱明辉，等.Nesfatin-1对大鼠胃酸分泌的影响［J］.世界华人消化杂志，2013，2（6）：1473-1479.

［15］ 周晚霞，杨慧，俞红，等.壳聚糖对大鼠胃损伤时黏膜的保护作用［J］.中国生化药物杂志，2009，30（5）：326-327.

［16］张月玲，迟太升，孙玉珍，等.胃癌组织中S-100蛋白表达的临床意义［J］.中国生化药物杂志，2012，33（5）：643-645.

（编校：谭玲）

Research on mechanism of nesfatin-1 in secreting gastric acid and pepsin in rat gastric mucosa

LIU Jin-zhou1，YANG Yan2，LIXue-liang3

（1.Department of Internal Medicine，Yichun People's Hospital of Jiangxi Province，Yichun 336000，China；2.Yichun Vocational Technical College，Yichun 336000，China；3.Department of Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo observe nesfatin-1 on gastric acid and pepsin secretion in rats gastric mucosa，and explore its possible mechanism.MethodsMale SD rats after intracerebroventricular catheter，respectively，in the lateral ventricle injection of nesfatin-1（0.05μg／rat），（0.5μg／rat）and an equal volume of sterile water（5μL／rat）.Used of collected gastric pylorus ligation，3 h after the ratswere sacrificed，measured changes in their gastric acid and pepsin，and was detected by RT-PCR in gastric tissue H＋-K＋-ATPase expression levels，detected by Western blot gastric mucosa histidine decarboxylase（histidine decarboxylase，HDC）expression levels of proteins，ELISA was used to detect gastric body mucosa histamine content.ResultsAfter injection nesfatin-1 3h in rats，compared with an equal volume of sterilewater for injection control group，the secretion of gastric acid and pepsin secretion was significantly reduced，and there was a significant difference（P＜0.01）.There were differences between the two groups and the administration of pepsin secretion，with statistical significance（P＜0.05）.Histamine secretion in rat gastric mucosa declined，there was a statistically significant difference（P＜0.05）.Compared with the control group，after administration，two groups of rats gastric H＋-K＋-ATP enzyme mRNA expression was significantly reduced，and there was a significant difference（P＜0.01）.Meanwhile protein expression in rat gastric mucosa HDC groups decreased significantly compared with the control group，with statistical significance（P＜0.05）.ConclusionIntracerebroventricular injection of nesfatin-1 could inhibit gastric acid and pepsin secretion，and itsmechanism of actionmay inhibit secretion of gastric acid through affecting the central nervous system，expression levels of H＋-K＋-ATP enzymemRNA，expression of key enzymes in histamine synthesis pathway.

lateral ventricle injection；rat；acid；pepsin

R573

A

1005－1678（2014）09－0046－04

国家自然科学基金（81070308）

刘锦宙，男，本科，副主任医师，研究方向：消化内科，E-mail：qch1821460064＠163.com。