倍他乐克联合右美托咪啶对心肌缺血再灌注大鼠NADPH氧化酶亚基-细胞外基质重构的机制研究

黄柳，杨蓉，李拥军，刘素云，张辉

（河北医科大学第二医院心内科，河北石家庄050000）

倍他乐克联合右美托咪啶对心肌缺血再灌注大鼠NADPH氧化酶亚基-细胞外基质重构的机制研究

黄柳，杨蓉Δ，李拥军，刘素云，张辉

（河北医科大学第二医院心内科，河北石家庄050000）

目的探讨倍他乐克联合右美托咪啶对心肌缺血再灌注大鼠烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，NADPH oxidase）亚基、单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）水平及细胞凋亡相关蛋白的影响。方法SD大鼠随机分为4组：假手术组（sham operation group，SO）、缺血再灌注组（ischemic perfusion group，IP）、NADPH氧化酶抑制剂apocynin治疗组（apocynin treatment group，AT）及倍他乐克联合右美托咪定组（metoprolol combined dexmedetomidine group，MD）。采用大鼠冠状动脉左前降支结扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型。Real-time PCR及Western blot方法分析各组大鼠血浆和心肌组织中NADPH亚基、MCP-1、MMP-2、MMP-9以及细胞凋亡相关蛋白—半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3（cysteine aspartic acid proteinase-3，Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白-9（cysteine aspartic acid proteinase-9，Caspase-9）的表达变化。结果与SO组相比，IP组大鼠血浆和心肌组织的NADPH氧化酶亚基、MCP-1、MMP-2及MMP-9的表达均显著增高（P＜0.01），同时细胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达也显著增高（P＜0.01），而AT组和MD组可部分恢复上述蛋白的异常表达。结论倍他乐克联合右美托咪定通过抑制心肌组织中NADPH氧化酶的过渡激活介导的MCP-1上调表达及细胞外基质重构缓解缺血再灌注引起的大鼠心肌损伤。

倍他乐克；右美托咪定；缺血再灌注大鼠心肌损伤；单核细胞趋化因子-1；基质金属蛋白酶；细胞外基质降解与重构

心肌缺血再灌注损伤即在一定条件下缺血心肌恢复血液再灌注后，缺血性损伤进一步加重的现象［1］。缺血再灌注不仅不能恢复组织及器官的正常功能，反而能够加重其结构异常和功能损伤。单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）与机体的炎症反应密切相关，是引起单核细胞或巨噬细胞发生浸润的重要趋化因子［2-3］。细胞外基质降解和重构是心肌组织结构及功能异常的重要基质，主要有基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）所介导［4-5］。基质金属蛋白酶活性增强，诱发心肌组织细胞外基质发生降解与重构，影响心肌的正常收缩、舒张功能［6-7］。已有的研究证实，多种组织中氧化应激与细胞外基质重构及炎症反应具有相关性［8-9］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，NADPH oxidase）即NADPH氧化酶是多亚基酶类，诱导细胞内反应氧自由基增多，细胞内氧化还原状态失衡。过多的反应氧自由基引起细胞内内质网功能异常及促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3（cysteine aspartic acid proteinase-3，Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白-9（cysteine aspartic acid proteinase-9，Caspase-9）等的过表达，导致细胞凋亡的发生。本研究旨在探讨倍他乐克联合右美托咪啶对心肌缺血再灌注大鼠NADPH亚基、MCP-1、MMP和细胞凋亡相关蛋白水平的影响，为相关研究及临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 40只清洁级成年SD大鼠购自上海斯莱克实验动物中心，合格证号SZXK（上）20080033，雌雄不拘，体质量（220±10）g；所有实验操作遵循《实验动物保护条例》。

1.2 试剂 Apocynin、倍他乐克及右美托咪定均购自美国Sigma Aldrich公司；ELISA试剂盒购自美国B＆D公司；MCP-1、MMP-2、MMP-9、Caspase-3和Caspase-9均购自Santa Cruz公司；p22phox、p47phox亚基抗体购自Abcam公司；二抗及显色试剂盒购自武汉博士德公司。脱脂奶粉购自内蒙古伊利乳业有限公司；HRP标记的羊抗小鼠／羊抗兔的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；mRNA提取及逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；SYBR Premix Ex Taq购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 仪器 ABI7700荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；引物合成购自上海生工生物有限公司；PVDF膜购自美国Amersham公司；电泳槽、电泳仪及蛋白转移系统购自美国ABI公司。

1.4 心肌缺血再灌注大鼠模型的建立 所有动物适应性饲养1周，自由饮食。SD大鼠随机分为4组，每组10只：SO组、IP组、AT组及MD组。研究采用大鼠冠状动脉左前降支结扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型：结扎冠状动脉左前降支前30min从右腔静脉注射生理盐水，结扎30min后松开并再行灌注120min。SO组仅穿线但不结扎冠状动脉左前降支。AT组（10mg／kg）和MD组（5mg／kg＋5mg／kg）于结扎前30min于右腔静脉注射。造模结束后逐层缝合肌肉、皮肤，大鼠手术切口处注射少许青霉素注射液，并用碘伏擦拭消毒，防止感染。

1.5 ELISA分析血浆中MCP-1及MMP2 大鼠处死前颈动脉放血处死动物并用内壁涂有肝素钠的离心管收集血液，立即离心（3000 r／min，10 min）并4℃保存。ELISA检测MCP-1及MMP-9水平均采用试剂盒，所有操作均严格按照说明书进行。

1.6 Real-time PCR mRNA提取及逆转录过程均严格按照说明书进行。Real-time PCR反应条件：95℃热启动10 min；94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，72℃收集荧光，共37个循环。反应体系为20μL：cDNA 2μL；Forward Primer（10 μM）0.5μL；Reverse Primer（10μM）0.5μL；2.5×SYBR Green（TianGen）8μL；蒸馏水9μL。

表1 荧光实时定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR assay

1.7 Western blot 心肌组织在冰水浴中用裂解液充分裂解，采用考马斯亮蓝法对蛋白定量后以等量蛋白进行SDS-PAGE和半干法转膜。转至PVDF膜上后1%BSA室温条件下封闭2 h。然后与一抗4℃温孵12 h，PBS漂洗3次后与二抗室温反应4 h。PVDF膜用PBS漂洗后用ECL混合液显色、曝光、显影、定影，用凝胶成像分析系统测定光密度，以β-actin作为参照，进行蛋白表达的定量分析。

1.8 统计学方法 应用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析，正态数据以“±s”表示，组间采用t检验，以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注大鼠血浆MCP-1及MMP-9水平的变化与SO组相比，IP组大鼠的MCP-1、MMP-9水平均显著增高（P＜0.01）；与IP组相比，AT组和MD组的上述指标显著降低（P＜0.01，见表2）。

表2 缺血再灌注大鼠血浆MCP-1及MMP-9水平的变化Tab.2 Change of MCP-1and MMP-9 in ischemic reperfusion rats

2.2 缺血再灌注大鼠心肌组织NADPH氧化酶亚基表达变化 与SO组相比，IP组大鼠的心肌组织NADPH氧化酶亚基p22phox及p47phox蛋白的表达水平均显著增高（P＜0.01）；与IP组相比，AT组和MD组的上述指标显著降低（P＜0.01，见图1）。

图1 缺血再灌注心肌组织NADPH氧化酶亚基表达变化Fig.1 Expressions of NADPH oxidase subunits in ischemic reperfusion heart in rats**P＜0.01，与SO组相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，与IP组相比，compared with IP group

2.3 缺血再灌注大鼠心肌组织MCP-1表达的变化 与SO组相比，IP组大鼠的心肌组织MCP-1蛋白的表达水平均显著增高（P＜0.01）；与IP组相比，AT组和MD组MCP-1显著降低（P＜0.01，见图2）。

图2 缺血再灌注心肌组织MCP-1表达变化Fig.2 Expression of MCP-1 in ischemic reperfusion heart in rats**P＜0.01，与SO组相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，与IP组相比，compared with IP group

2.4 缺血再灌注心肌组织MMP-2和MMP-9表达的变化与SO组相比，IP组大鼠的心肌组织MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白的表达水平均显著增高（P＜0.01）；与IP组相比，AT组和MD组的上述指标显著降低（P＜0.01，见图3）。

图3 缺血再灌注心肌组织MMP-2及MMP-9表达变化Fig.3 Expression of MMP-2 and MMP-9 in ischemic reperfusion heart inmRNA and protein level in rats**P＜0.01，与SO组相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，与IP组相比，compared with IP group

2.5 缺血再灌注心肌组织Caspase-3及Caspase-9表达的变化 与SO组相比，IP组大鼠的心肌组织细胞凋亡相关蛋白Cpasase-3及Caspase-9蛋白的表达均显著增高（P＜0.01），且NADPH氧化酶抑制剂AT组和MD组上调上述凋亡蛋白的异常表达，且差异具有统计学意义（P＜0.01，见图4）。

图4 缺血再灌注心肌组织Caspase-3及Caspase-9蛋白表达Fig.4 Expression of Caspase-3 and Caspase-9 in ischemic reperfusion heart in rats**P＜0.01，SO组相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，与IP组相比，compared with IP group

3 讨论

缺血再灌注损伤即心肌在较短的时间内发生供血中断，并在一定时间内恢复血液供应而发生的比供血前损伤更严重的现象。缺血再灌注可以导致几乎临床上所有类型的心肌组织的结构和功能异常。高浓度的氧自由基可以导致细胞氧化还原状态的失衡，进而损伤心肌细胞［10］。已有的证据显示氧化应激在缺血再灌注损伤中具有广泛的参与作用［1，6］。本研究通过大鼠冠状动脉左前降支结扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型研究倍他乐克联合右美托咪啶对心肌缺血再灌注大鼠NADPH亚基、MCP-1、MMP水平和细胞凋亡蛋白的影响。结果发现与SO组相比，IP组大鼠血浆和心肌组织的NADPH氧化酶亚基、MCP-1、MMP-2及MMP-9的表达均显著增高，同时细胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达也显著增高。而apocynin和倍他乐克联合右美托咪定可部分恢复上述蛋白的异常表达。因此，倍他乐克联合右美托咪定通过抑制NADPH氧化酶的过渡激活介导的MCP-1及MMP上调表达缓解缺血再灌注引起的大鼠心肌损伤。

研究表明倍他乐克通过抑制炎症反应减轻心肌胶原沉积，发挥改善心肌梗死后胶原重构的作用［11］。右美托咪定临床上多用于全身麻醉手术患者气管插管及机械通气时镇静。研究证实右美托咪定在缺血再灌注脑损伤缓解方面具有显著的作用，且右美托咪定确实能减轻脑缺血后超微结构的损伤［12］。同时，右美托咪定也可以通过减少缺血再灌注后炎症因子的生成降低血浆中的I-FABP浓度发挥对缺血再灌注肠道损伤的保护作用［13］。本文中发现倍他乐克联合右美托咪定可以显著恢复大鼠血浆和心肌组织的NADPH氧化酶亚基、MCP-1、MMP-2及MMP-9的表达均明显增高，同时对异常增高的细胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达也具有明显的抑制作用，提示2者联合使用可能是通过抑制NADPH氧化酶介导的氧化应激作用，进一步抑制单细胞趋化因子活性增强以及细胞外基质重构发挥治疗缺血再灌注的作用。

细胞外基质降解和重构是心肌损伤的重要机制，可以严重影响正常心肌的结构与功能。以往研究也证实，大鼠脑在缺血再灌注后MMP-2和MMP-9均表现为明显的升高趋势，MMP-2的异常表达与缺血再灌注的水肿形成有关［14］。另外，在研究大鼠局灶性缺血／再灌注模型时发现，通过抑制MMP-2和MMP-9的表达能对血脑屏障超微结构的保护作用［15］。在本研究中发现，大鼠冠状动脉左前降支结扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型中血浆MMP-9水平及心肌组织MMP-2和MMP-9的表达均明显增高，提示该模型大鼠心肌组织中存在细胞外基质降解与重构。而NADPH氧化酶抑制剂Apocynin可以抑制异常表达的MMPs，表明缺血再灌注损伤可能是由氧化应激介导的细胞外基质重构参与的。这与以往的研究基本一致［16-17］。

因此，倍他乐克联合右美托咪定通过抑制NADPH氧化酶的过渡激活介导的MCP-1上调表及心肌组织细胞外基质重构缓解缺血再灌注引起的大鼠心肌损伤。

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（编校：王冬梅，谭玲）

Effect ofmetoprolol combined dexmedetom ide on NADPH oxidase subunit and extracellular matrix rexombination in ischem ic reperfusion rats

HUANG Liu，YANG RongΔ，LIYong-Jun，LIU Su-Yun，ZHANG Hui

（Cardiology，The Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo investigate the effect ofmetoprolol combined dexmedetomide on NADPH oxidase subunit，MCP-1，MMP and apoptosis related protein in ischemic reperfusion rats.MethodsSD ratswere divided into 4 groups：sham operation group（SO），ischemic perfusion group（IP），apocynin treatment group（AT）and metoprolol combined dexmedetomide group（MD）.Myocardial ischemia-reperfusion injunymodel was established by ligation of left anterior descending coronary artery（LAD）method.The expression of NAPDH，MCP-1，MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot or Real-time PCR.The apoptosis related protein Caspase-3 and Caspase-9 were also assayed in each group.ResultsThe expression of NADPH oxidease subunit，MCP-1，MMP-2，MMP-9 was increased greatly in IP group when compared with SO group（P＜0.01），as well as apoptosis related protein Caspase-3 and Caspase-9 were up-regulated dramatically in IP group when compared with SO group（P＜0.01），while AT group and MD group could recover these parameters greatly.ConclusionMetoprolol combined dexmedetomide alleviates ischemic perfusion injurymediated by theway of increasing MCP-1 expression by inhibiting activated NADPH oxidase in heart and inhibiting extracellularmatrix recombination.

metoprolol；dexmedetomidine；ischemic perfusion heart injury；MCP-1；MMP；extracellularmatrix recombination

R966

A

1005－1678（2014）09－0042－04

河北省卫生厅重点科技研究计划基金项目（20110084）

黄柳，男，硕士，住院医师，研究方向：心血管内科学，E-mail：huangliu90＠163.com；杨蓉，通信作者，女，博士，副主任医师，研究方向：冠心病、心衰、高脂血症的诊治，E-mail：yangr877＠163.com。