香菇多糖对5-FU抑制胃癌细胞增殖的影响及可能机制

关秀文，韦炳邓，杨军，杜寒松，张万里，牛彦锋Δ

（1.江汉大学附属第三医院普外科，湖北武汉430300；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科，湖北武汉430022）

香菇多糖对5-FU抑制胃癌细胞增殖的影响及可能机制

关秀文1，韦炳邓1，杨军1，杜寒松2，张万里2，牛彦锋2Δ

（1.江汉大学附属第三医院普外科，湖北武汉430300；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科，湖北武汉430022）

目的研究香菇多糖对5-FU抑制胃癌细胞增殖的影响及可能机制。方法体外培养AGS胃癌细胞，分为CON组（未加入香菇多糖和5-FU）、LEN组（仅香菇多糖培养）、FNM组（仅5-FU培养）和L＋F组（香菇多糖和5-FU培养），比较4组细胞增殖、细胞周期、增殖指数（proliferation index，PI）、凋亡率、多重耐药基因（multidrug resistance 1，MDR1）和多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated proteins，MRP）表达的差异。结果LEN组和CON组D1～D7吸光值的差异无统计学意义，但均显著高于FNM组和L＋F组吸光值（P＜0.05），且L＋F组细胞D1～D7的吸光值均显著低于FNM组（P＜0.05）。CON组和LEN组AGS胃癌细胞G0／G1期和凋亡率均显著低于FMN组和L＋F组（P＜0.05），S期和G2／M期均显著高于FMN组和L＋F组（P＜0.05）；L＋F组AGS胃癌细胞G0／G1期和凋亡率均显著高于FNM组（均P＜0.05），S期和G2／M期低于FNM组（均P＜0.05）。CON组和FNM组AGS胃癌细胞MDR1和MRP表达均显著高于LEN组和L＋F组（P＜0.05）；L＋F组MDR1和MRP表达均显著低于LEN组（P＜0.05）。结论香菇多糖可显著增强5-FU对AGS细胞增殖的抑制作用，其作用机制可能与降低耐药基因MDR1和MRP表达有关。

胃癌；香菇多糖；5-FU；增殖；机制

香菇多糖是目前广泛应用的化疗药物，为治疗肿瘤时的辅助用药，可显著提高化疗药物的有效率并降低不良反应，但目前对其作用机制尚未完全明确［1-2］。有研究表明：香菇多糖在体内可通过改善T淋巴细胞免疫和细胞毒性T细胞的免疫力而增强化疗的疗效［3］，体外实验表明香菇多糖同样具有抑制肿瘤的作用［4］，因体外实验缺乏体内实验的免疫环境，推测可能存在其他作用机制。本研究采用香菇多糖联合5-FU处理AGS胃癌细胞，分析多重耐药基因（multidrug resistance 1，MDR1）和（multidrug resistance-associated proteins，MRP）表达的差异，探讨香菇多糖对5-FU抑制胃癌细胞增殖的影响及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 AGS人胃癌细胞购于美国典型培养物保藏中心；胎牛血清和DMEM购自Hyclone公司；香菇多糖为南京康海药业有限公司的香菇多糖冻干粉剂（国药准字H10950078）；5-FU购于Sigma公司。

1.2 细胞培养和药物处理 AGS胃癌细胞完全培养基为10%胎牛血清和90%DMEM，培养条件在37℃、5%CO2恒温培养箱。根据培养方法分为CON组（仅完全培养基培养，未加入香菇多糖和5-FU处理）、LEN组（完全培养基及香菇多糖培养，香菇多糖终浓度0.2μmol／L）、FNM组（完全培养基及5-FU培养，5-FU终浓度2μg／m L）和L＋F组（完全培养基、香菇多糖和5-FU培养，香菇多糖终浓度0.2μmol／L，5-FU终浓度2μg／mL）。

1.3 细胞增殖检测 采用MTT法检测4组AGS胃癌细胞增殖情况，检测处理前（D0）和处理D1～D7后的吸光值变化，吸光值＝所测吸光度-空白对照组吸光度。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。

1.4 细胞周期和凋亡检测 采用流式细胞仪检测4组AGS胃癌细胞细胞周期、增殖指数（proliferation index，PI）和凋亡率，其中PI＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）。

1.5 MDR1和MRP表达 采用Western blot检测多药耐药基因MDR1和MRP表达，以β-actin作为内参。产物经凝胶电泳后显影拍照。

1.6 统计学方法 采用Sigma Plot 11.0进行统计学分析。4组细胞均数间的多重比较采用Student-Newman-Keuls法两两比较计算P值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖曲线 4组AGS胃癌细胞D0吸光值无明显差异；LEN组和CON组D1～D7的吸光值的差异无统计学意义，但均显著高于FNM组和L＋F组吸光值（P＜0.05）；L＋F组细胞D1～D7的吸光值显著低于FNM组（P＜0.05，见图1）。

图1 4组AGS胃癌细胞D0～D7吸光值比较*P＜0.05，与FNM组对比Fig.1 Comparison of D0～D7's OD in AGS gastric cancer cells among four groups *P＜0.05，compared with FNM group

2.2 细胞周期、PI和凋亡率 CON组和LEN组AGS胃癌细胞G0／G1期、S期、G2／M期、PI和凋亡率的差异均无统计学意义，但G0／G1期和凋亡率均显著低于FMN组和L＋F组（P＜0.05），S期和G2／M期均显著高于FMN组和L＋F组（P＜0.05）；L＋F组AGS胃癌细胞G0／G1期和凋亡率均显著高于FNM组（P＜0.05），S期和G2／M期低于FNM组（P＜0.05，见表1）。

表1 4组AGS胃癌细胞周期、PI和凋亡率比较（%）Tab.1 Comparison of cell cycle，PIand apoptosis rate of AGS gastric cancer cells in four groups（%）

2.3 MDR1和MRP表达 CON组和FNM组AGS胃癌细胞MDR1和MRP表达无明显差异，但均显著高于LEN组和L＋F组（P＜0.05）；L＋F组MDR1和MRP表达显著低于LEN组（P＜0.05，见图2、图3）。

图2 4组细胞MDR1基因蛋白质表达比较*P＜0.05，与LEN组相比Fig.2 Comparison of MDR1 protein expressions in four groups*P＜0.05，compared with LEN group

图3 4组细胞MRP基因蛋白质表达对比*P＜0.05，与LEN组相比Fig.3 Comparison of MRP protein expressions in four groups*P＜0.05，compared with LEN group

3 讨论

5-FU是一种S期特异性药物，通过抑制DNA合成导致细胞周期停滞和细胞凋亡，是目前临床上综合治疗胃癌最常见的化疗药物［5］。临床研究表明：以5-FU为主体的多药联合化疗在治疗胃癌后可获得耐药性，导致患者病情进展从而更换二线化疗方案，其产生耐药性导致有效率下降的作用机制可能与耐药基因有关，目前报道的相关基因包括MDR1和MRP等［6-7］，这些耐药基因的表达增加或激活会导致化疗药物无法产生抗肿瘤作用。MDR1为位于细胞膜的一种P-糖蛋白，含有2个ATP结合位点，跨膜区域构成药物通道盒式结构，利用ATP水解供能将化疗药物泵出胞膜外，导致化疗药物无法与肿瘤细胞结合［8-9］；MRP属于非P跨膜糖蛋白，可将化疗药物分子逆浓度泵出细胞外，从而降低化疗药物在细胞内的浓度，同时可改变肿瘤细胞内的pH值，抑制化疗药物与靶点的结合，导致化疗药物失去作用［10-11］。体外实验表明：化疗药物反复作用于肿瘤细胞可导致耐药基因MDR1和P-gp等表达增加而产生耐药细胞株［12-13］，说明抑制耐药基因的表达对增加化疗药物抑制肿瘤细胞增殖具有重要作用。本研究中，CON组和FNM组胃癌细胞MDR1和MRP表达无明显差异，表明AGS胃癌细胞存在耐药基因表达。

香菇多糖是目前常用的增强化疗药物疗效的辅助用药，可显著提高化疗药物的有效率并降低其不良反应，这与其改善T淋巴细胞免疫和细胞毒性T细胞的免疫力有关［14-15］。体外实验表明香菇多糖同样具有抑制肿瘤的作用，但目前尚无证据表明香菇多糖自身对肿瘤细胞具有杀灭作用，推测其可能存在其他作用机制。本研究中，香菇多糖单独处理AGS胃癌细胞后，MDR1和MRP表达显著降低，表明香菇多糖可改善肿瘤细胞耐药状况。进一步研究发现，LEN组和CON组D1～D7的吸光值均显著高于FNM组和L＋F组吸光值（P＜0.05）；L＋F组细胞D1～D7的吸光值显著低于L＋F组（P＜0.05）；CON组和LEN组AGS胃癌细胞G0／G1期和凋亡率均显著低于FMN组和L＋F组（P＜0.05），S期和G2／M期均显著高于FMN组和L＋F组（P＜0.05）；L＋F组AGS胃癌细胞G0／G1期和凋亡率均显著高于FNM组（P＜0.05），S期和G2／M期低于FNM组（P＜0.05），本实验首次发现香菇多糖可通过改善MDR1和MRP表达而增强5-FU对AGS胃癌细胞的抑制作用，为香菇多糖体外抗癌提供了客观证据。此外，有研究发现香菇多糖能够显著抑制SGC-7901胃癌细胞的生长，能够引起S期细胞周期阻滞，激活ERK1／2磷酸化，认为香菇多糖的体外抗肿瘤活性可能与诱导细胞周期阻滞和激活ERK1／2信号通路有关［16］。但本研究中CON组和LEN组的增殖曲线、细胞增殖和凋亡均无明显差异，与该文献结果存在差异，说明香菇多糖自身是否对肿瘤细胞具有直接的抑制作用尚不能下结论，有待于进一步研究。

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（编校：吴茜）

Effect of lentinan on gastric cancer cell's proliferation inhibited by 5-FU and its possiblemechanism

GUAN Xiu-wen1，WEIBing-deng1，YANG Jun1，DU Han-song2，ZHANGWan-li2，NIU Yan-feng2Δ

（1.Department of General Surgery，The Third Affiliated Hospital of Jianghan University，Wuhan 430300，China；2.Department of General Surgery，Union Hospital，TongjiMedical college，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China）

ObjectiveTo study the effect of lentinan on gastric cancer cell's proliferation inhibited by 5-FU and its possiblemechanism.MethodsGastric cancer AGS cell line were divided into CON group（no lentinan and 5-FU treatment），LEN group（only lentinan treatment），FNM group（only 5-FU treatment）and L＋F group（lentinan and 5-FU treatment）according to their treatmentmethod.The cell proliferation，cell cycle，proliferation index（PI），apoptosis rate and expressions ofMDR1 and MRPwere detected and compared.ResultsThe absorbance of D1～D7，S stage，G2／M stage，expressions of MDR1 and MRP in CON group and LEN group were significantly higher than those in FNM group and L＋F group（P＜0.05）.The absorbance of D1～D7，S stage，G2／M stage，expressions of MDR1 and MRP in L＋F group were significantly lower than those in FNM group（P＜0.05），but the G0／G1 stage and apoptosis rate were higher（P＜0.05）.Conclusion Lentinan could significantly promote inhibition effects of5-FU on AGS gastric cancer cell line through lowering expressions of MDR1 and MRP.

gastric cancer；lentinan；5-FU；proliferation；mechanism

R656.6

A

1005－1678（2014）08－0081－03

湖北省自然科学基金（2013CFB115）

关秀文，男，硕士，研究方向：消化道肿瘤诊断与治疗，E-mail：329703831＠qq.com；牛彦锋，通信作者，男，博士，研究方向：胃肠道肿瘤诊断与治疗，E-mail：895698990＠qq.com。