泛素交联酶UBE2D3在调节人乳腺癌MCF-7细胞放射敏感性中的作用

朱强，王丕琳，张铁，尹子毅，曲更宝，殷咏梅

（1.首都医科大学附属北京天坛医院乳腺科，北京100050；2.南京医科大学乳腺科，江苏南京210029）

泛素交联酶UBE2D3在调节人乳腺癌MCF-7细胞放射敏感性中的作用

朱强1，王丕琳1，张铁1，尹子毅1，曲更宝1，殷咏梅2

（1.首都医科大学附属北京天坛医院乳腺科，北京100050；2.南京医科大学乳腺科，江苏南京210029）

目的研究泛素交联酶UBE2D3（ubiquitin-conjugating enzyme E2D3）在端粒酶介导的放射敏感性调节机制中的作用。方法针对UBE2D3基因序列，设计3条干扰序列，通过筛选选取1条干扰效率最优的序列并合成pshRNA-UBE2D3；在MCF-7细胞中，转染过表达质粒pEGFP-UBE2D3以及干扰质粒pshRNA-UBE2D3，Western blot检测UBE2D3对hTERT蛋白表达的影响；通过转染pEGFP-hTERT，Western blot法检测hTERT蛋白表达对UBE2D3的影响；通过转染pshRNA-UBE2D3抑制UBE2D3的表达，PCR-ELISA法检测端粒酶活性，MTT法检测MCF-7细胞周期的变化，CCK-8法检测MCF-7细胞增殖情况，克隆形成法检测MCF-7细胞放射敏感性的变化。结果成功筛选出一条针对UBE2D3的最优干扰序列，干扰UBE2D3能显著降低MCF-7细胞的放射敏感性；UBE2D3能参与hTERT调控放射敏感性的调节，抑制UBE2D3的表达可能通过上调hTERT和Cyclin D1的表达、增加hTERT的活性、加速G1期向S期转变以及提高MCF-7细胞的增殖从而降低MCF-7细胞的放射敏感性。然而，过表达UBE2D3未能检测到hTERT的表达差异。结论抑制UBE2D3可能通过上调hTERT以及Cyclin D1的表达参与hTERT调节的放射敏感性的过程。

泛素交联酶UBE2D3；放射敏感性；蛋白相互作用；乳腺癌

泛素-蛋白酶体复合通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是Hershko等研究者在20世纪末发现的一种高效的蛋白质降解的通路，该通路不但能够破坏损伤陈旧的蛋白质，而且能够通过精确降解细胞内各种目的靶蛋白，进而参与细胞周期的调控、细胞凋亡、DNA修复、细胞信号的转导、蛋白的跨膜定位和细胞表面膜受体的内化等多种生理过程，与许多疾病的发生有关，尤其与肿瘤的发生有着密切的相关性［1-2］。泛素（ubiquitin）是一个高度保守的、长76个氨基酸残基的小肽，它以单体或与其他蛋白结合的形式广泛存在真核生物中，不仅是蛋白质降解的标记，更在DNA修复、基因转录调控及信号转导等生命活动中发挥着重要的作用［3］。为此选取UBE2D3作为研究对象，研究UBE2D3在端粒酶介导的放射敏感性调节机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种、细胞株 质粒：过表达质粒pEGFPUBE2D3用于真核表达；干扰质粒pshRNA-UBE2D3用于真核表达；菌种及细胞株：E.coli DH5α购自天根生化公司，MCF-7细胞由江西省肿瘤生物行为学实验室保存。

1.2 培养基及试剂 DMEM培养基购于美国HyClone公司，胎牛血清（FBS）购于杭州四季青生物工程有限公司。胰蛋白胨（trytone）、酵母提取物（yeast extract）、琼脂粉（agar）购自OXOID公司。琼脂糖购自西班牙Agarose公司。其它试剂均为国产分析纯产品。细胞总RNA提取试剂Trizol reagent、转染试剂LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶和dNTP购自Promega公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；DNA Marker、PCR Mix均购自天根生化公司；BCA蛋白测定试剂盒、细胞周期检测试剂盒购自碧云天公司；端粒酶活性试剂盒购自Roche公司；CCK-8试剂盒购自Dongji公司；DNA测序由Invitrogen公司完成。

1.3 主要仪器 Bio 1200-II-A2型生物安全柜（上海振梓创）；SW-CJ-1F型洁净工作台（苏州安泰）；MCO-175型CO2恒温培养箱、－20℃医用冰箱、－70℃超低温冰箱、OLYMPUS倒置普通显微镜、OLYMPUS倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS）；TGL-16G台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）；Microfuge-22R台式微量冷冻离心机（美国Beckman）；Allerga X-12R多功能离心机（美国Beckman）；细胞计数仪（Invitrogen）；A1604型精密天平（上海天平仪器厂）；WGP-350隔水式电热恒温培养箱（上海安亭）。

1.4 方法

1.4.1 针对UBE2D3基因序列，设计3条干扰序列，通过筛选选取1条干扰效率最优的序列并合成pshRNA-UBE2D3；在MCF-7细胞中，转染过表达质粒pEGFP-UBE2D3以及干扰质粒pshRNA-UBE2D3。

1.4.2 Western blot检测UBE2D3对hTERT蛋白表达的影响：取适量25mg／mL蛋白标准溶液稀释至终浓度0.5mg／mL，同时按50∶1比例分别加入适量试剂A和试剂B配制BCA工作液；试剂准备完毕后，于96孔板中分别加入0、1、2、4、8、12、16、20μL标准品以及10μL的待测样品，补足稀释液至20μL；每孔加入BCA工作液200μL，37℃孵育30min；使用酶标仪测定562 nm的吸光度，绘制标准曲线并计算蛋白浓度。

1.4.3 通过转染pEGFP-hTERT，Western blot法检测hTERT蛋白表达对UBE2D3的影响：将4μL LipofectamineTM 2000分别加入2个500μLOPT-MEM培养基的EP管中，轻柔混匀，且室温孵育5min。将上述2种稀释液分别混匀，室温培育20min后加入培养皿中，培养箱常规培养。4～6 h后，轻柔弃除转染混合物，切忌用力吹打，用吸管沿瓶壁缓慢更换上新鲜的完全培养基；48 h后，按照标准步骤分别提取蛋白，利用BCA法检测蛋白浓度。

1.4.4 干扰UBE2D3对MCF-7细胞增殖的影响：CCK-8法采用的主要试剂是WST-8，它是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。如果细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。以转染pshRNA-UBE2D3的MCF-7细胞为实验组，pshRNA-NC为对照组。

1.4.5 干扰UBE2D3对MCF-7细胞放射敏感性的影响：将处于冻存管内冻存的MCF-7细胞置于37℃水浴中温浴，待细胞溶化后，用75%乙醇消毒管壁外测尽量保持无菌，超净工作台内将熔化的细胞转到另一个15mL无菌离心管中，加入10mL含有10%FBS的DMEM培养基，2000 rpm，离心5min；收集细胞，弃上清；再加入5mL含有10%FBS的DMEM培养基中，用吸管轻柔吹打，重悬细胞，将细胞接种至细胞培养瓶中，置于5%C02培养箱中，37℃常规培养；提前1 d准备处于对数生长的人乳腺癌MCF-7细胞，消化，均匀种于25 cm2细胞培养瓶；待细胞状态良好，按照之前转染步骤，按照无菌原则将pshRNA-UBE2D3（实验组）、pshRNA-NC（对照组），采用线性二次模型拟合细胞存活曲线，通过曲线计算细胞存活分数为0.5时，对照组与实验组的放射剂量比值为放射增敏比（sensitizer enhancementratio，SER）。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行数据处理，Western blot、端粒酶活性检测、细胞增殖检测、细胞周期检测、克隆形成实验均重复至少3次，端粒酶活性检测、细胞增殖检测采用t检验，克隆形成实验数据采用Graphpad prism 5.0软件分析，按照线性二次模型拟合生存曲线，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UBE2D3干扰最佳序列筛选以及过表达质粒pEGFPUBE2D3的构建 为了研究UBE2D3在放射敏感性中的作用，共设计3条干扰序列，分别将3条序列转染至MCF-7细胞，进而筛选出1条干扰效率最好的干扰序列。如图1A所示，转染后，Line-1（siRNA-486）显示最好干扰效率，选取干扰序列siRNA-486，用以构建pU6／GFP／Neo-shRNA-UBE2D3，简称pshRNAUBE2D3。同时，构建pEGFP-UBE2D3，如图1B所示，测序完全正确。

图1 UBE2D3干扰序列筛选结果（A）及pEGFP-UBE2D3双酶切鉴定结果（B）Fig.1 UBE2D3 interference sequence screening results（A）and pEGFP-UBE2D3 double enzyme digestion identification results（B）

2.2 干扰、过表达UBE2D3对MCF-7细胞中hTERT蛋白表达影响 以重组质粒pEGFP-UBE2D3、pshRNA-UBE2D3为实验组，pshRNA-NC作为对照组，转染MCF-7细胞24 h后，荧光显微镜观察转染效率（图2A），实验组以及对照组转染效率均在80%左右；48 h后提取蛋白，WB检测干扰、过表达UBE2D3后，hTERT的蛋白表达变化。如图2B所示，转染pEGFP-UBE2D3后，UBE2D3蛋白表达水平增加，hTERT蛋白水平较对照组未见明细变化；而转染pshRNA-UBE2D3后，UBE2DE3蛋白表达水平降低，hTERT蛋白水平较对照组明显增加。

图2 荧光显微镜观察转染效率（A）及Western blot检测蛋白表达（B）Fig.2 Transfection efficiency observed by fluorescentmicroscope（A）and protein expression detected by Western blot（B）

2.3 过表达hTERT对MCF-7细胞中UBE2D3蛋白表达的影响 为了研究hTERT的表达对MCF-7细胞中UBE2D3蛋白表达的影响，以重组质粒pEGFP-hTERT为实验组，pEGFP-C1作为对照组，转染MCF-7细胞24 h后，荧光显微镜观察转染效率（图3A），实验组以及对照组转染效率均在70%左右；48 h后提取蛋白，Western blot检测过表达hTERT对UBE2D3的蛋白表达变化的影响。如图3B所示，转染pEGFP-hTERT后，hTERT蛋白表达水平较对照组升高，而UBE2DE3蛋白表达较对照组未见明显变化；

图3 荧光显微镜观察转染效率（A）及Western blot检测蛋白表达（B）Fig.3 transfection efficiency observed by fluorescentmicroscope（A）and protein expression detected by Western blot（B）

2.4 干扰UBE2D3对MCF-7细胞端粒酶活性的影响 为了检测UBE2D3对MCF-7细胞端粒酶活性的影响，采用TRAPPCR-ELISA法进行检测，结果在不加放射线的情况下，实验组（转染pshRNA-UBE2D3）与对照组（pshRNA-NC）相比，MCF-7细胞端粒酶活性明显升高；在加放射线的情况下，实验组（转染pshRNA-UBE2D3）与对照组（pshRNA-NC）相比，MCF-7细胞端粒酶活性也明显升高，有统计学意义（P＜0.05，见图4）。

图4 PCR-ELISA检测端粒酶活性Fig.4 PCR-ELISA detection of telomerase activity

2.5 干扰UBE2D3对MCF-7细胞增殖的影响 为研究UBE2D3对MCF-7细胞增殖的影响，通过转染pshRNA-UBE2D3抑制UBE2D3的表达，采用CCK-8法分别在1、2、3、4、5、6、7 d，共7个时间点检测MCF-7细胞的增殖情况，经pshRNA-UBE2D3处理过的MCF-7细胞较转染pshRNA-NC的MCF-7细胞，从第2天开始出现增殖差异，且均存在统计学意义（P＜0.05）。

图6 CCK-8法检测MCF-7细胞增殖Fig.6 The proliferation of MCF-7 cellsmeasured with CCK-8 method

2.6 干扰UBE2D3对MCF-7细胞放射敏感性的影响 在明确干扰质粒pshRNA-UBE2D3对hTERT的表达效应后，分别转染pshRNA-UBE2D3和阴性对照组pshRNA-NC至MCF-7细胞。转染24 h后，进行克隆形成实验检测各组细胞放射敏感性的变化。MCF-7细胞转染pshRNA-UBE2D3和阴性对照组pshRNANC后，采用线性二次模型拟合照射后细胞的存活曲线，计算细胞的α值、β值以及SF2（2 Gy照射后细胞的存活分数）；SF2分别为0.6939、0.5838，UBE2D3可能参与MCF-7细胞放射敏感性的调节（见表1）。

表1 细胞的α值、β值以及SF2Tab.1 Values ofα，βand SF2 of cells

3 讨论

基于泛素连接酶E3在泛素蛋白酶体系统中的底物特异性，目前关于泛素蛋白酶体系统的研究主要集中在泛素连接酶E3上，这些泛素连接酶E3主要包括BRCA1、RNF8、RNF168、Siah2、Mdm2、MKRN1、Chfr等。有研究发现泛素-蛋白酶体通路特异性阻断剂MG-132对SGC-7901细胞有显著抑制作用，同时端粒酶活性也相应降低［4-6］；另外的研究组发现MKRN1蛋白可标记需要降解的hTERT，并通过促进hTERT的降解导致端粒酶活性降低［11］；另外乳腺癌相关基因BRCA1能够下调c-myc的活性［7-9］，还能够与c-myc结合，从而抑制c-myc对hTERT的转录调节［10-11］，BRCA1基因敲除导致hTERT表达增加，端粒酶活性增强，端粒长度延长。此外，近来有研究者发现Hdm2作为一种泛素E3连接酶，可使hTERT多泛素化从而抑制端粒酶的活性［12-14］。而本研究中，通过酵母双杂交技术筛选出与hTERT相互作用的蛋白泛素交联酶UBE2D3，并初步研究证实2者之间的相互作用。由于UBE2D3与UBE2N都属于泛素交联酶E2家族成员，这是否意味着，UBE2D3在放射敏感性的调节中也具有重要意义。为此进行了相关的研究。研究表明，抑制UBE2D3的表达可以加速MCF-7细胞G1期向S期的进程，增加MCF-7细胞的增殖，进一步通过Western blot检测研究发现，抑制UBE2D3的表达能上调Cyclin D1的表达，进而解释了细胞周期、增殖变化的原因。

与此同时，通过抑制UBE2D3的表达，可以上调hTERT的表达，增加MCF-7细胞的端粒酶活性。虽然对射线影响端粒酶活性存在不同的看法，前期的研究发现射线能诱导端粒酶活性增加。另外，也有研究显示，hTERT的上调与端粒酶活性、细胞增殖存在正相关，上调hTERT的表达能上调Cyclin D1的表达［15］。但是过表达UBE2D3后，并没有检测到hTERT蛋白水平的变化，因此猜测，hTERT可能是UBE2D3的靶蛋白，hTERT的降解可能是通过泛素化修饰完成，但UBE2D3存在与之对应的E3连接酶，过表达UBE2D3并不能引起相应具有底物特异性E3的增加，因此并不能引起hTERT蛋白表达的变化。发现，通过抑制UBE2D3的表达，乳腺癌MCF-7细胞的放射敏感性降低。放射敏感的降低归因于端粒酶活性的增加以及Cyclin D1的增加。干扰UBE2D3能上调hTERT以及Cyclin D1的表达，同时增加端粒酶的活性，干扰UBE2D3联合放疗，相对于单纯干扰组，端粒酶活性明显增加。综上所述，研究成果显示，除端粒酶-直接端粒延伸途径可以成为放射增敏的靶点之外，端粒酶介导的非直接端粒延伸途径，即端粒酶-泛素交联酶-端粒调控通路，可能成为以后放射增敏研究的发展方向，为以后肿瘤细胞放射敏感性调控的研究及发展新的放射增敏／放射防护靶点提供思路。

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（编校：谭玲，秦晓英）

Effect of UBE2D3 in regulation of radiosensitivity in human breast cancer MCF-7 cell

ZHU Qiang1，WANG Pi-lin1，ZHANG Tie1，YIN Zi-yi1，QU Geng-bao1，YIN Yong-mei2

（1.Department of Mammary Gland，Beijing Tiantan Hospital Affiliated Capital Medical University，Beijing 100050，China；2.Department of Mammary Gland，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the role of UBE2D3 in hTERT-mediated radiosensitivity in MCF-7 cells.MethodsBased on UBE2D3 gene sequences，three interference sequence were designed and a optimal jamming efficiency sequence was selected to synthesize pshRNA-UBE2D3.In MCF-7 cells，pEGFP-UBE2D3 and pshRNA-UBE2D3 were transfected respectively，and the influence of UBE2D3 on hTERT protein expression was detected by Western blot.Through transfection of pEGFP-hTERT，the influence of hTERT protein expression on UBE2D3 was detected by Western blot. UBE2D3 expression was dampened by pshRNA-UBE2D3 transfection，telomerase activity was detected by PCR-ELISA，the change of MCF-7 cell cycle was detected by MTT，MCF-7 cell proliferation was detected by CCK-8 and the change of MCF-7 cellular radiosensitivity was detected by colony-forming assay.ResultsAn optimal jamming efficiency sequence was selected，which could significantly reduce the radiosensitivity of MCF-7 cell；UBE2D3 could participate in the regulation of hTERT radiosensitivity，inhibit UBE2D3 expression，up-regulate hTERT and Cyclin D1expression，increase the activity of hTERT，accelerate G1 turn to S phase，and improve the MCF-7 cell proliferation to reduce the MCF-7 cell radiosensitivity.However，overexpression of UBE2D3 failed to detect the expression differences of hTERT.Conclusion UBE2D3 is inhibited by up-regulating hTERT and Cyclin D1expression to participate in the regulation of hTERT radiosensitivity.

UBE2D3；radiosensitivity；protein interaction；breast cancer

R737.9

A

1005－1678（2014）08－0077－04

国家自然科学基金（81172503）

朱强，男，硕士，住院医师，研究方向：乳腺疾病诊疗及乳腺癌综合治疗，E-mail：qch1821460072＠163.com。