汉防己甲素对脊柱损伤模型大鼠m iRNA-24和Bim蛋白表达的影响

邓必权，侯铁胜，傅强，胡华，熊军

（1.武汉市中心医院脊柱外科，湖北武汉430014；2.第二军医大学附属长海医院骨科，上海200433）

汉防己甲素对脊柱损伤模型大鼠m iRNA-24和Bim蛋白表达的影响

邓必权1，侯铁胜2，傅强2，胡华1，熊军1

（1.武汉市中心医院脊柱外科，湖北武汉430014；2.第二军医大学附属长海医院骨科，上海200433）

目的探究汉防己甲素对脊柱损伤模型大鼠miRNA-24和Bim蛋白表达的影响。方法114只Wistar大鼠，随机分为3组，其中正常组35只，模型组36只，干预组43只。采用加速压迫型Allen's打击法对模型组及干预组大鼠造成脊柱损伤模型。3组大鼠在相同环境下饲养，造模成功后给予干预组大鼠静滴汉防己甲素20mg／（kg·d），2周为1个疗程；正常组和模型组给予等体积生理盐水。给药结束后，比较3组大鼠miRNA-24和Bim蛋白表达水平。结果治疗后1、5、10 d，与正常组比较，模型组及干预组大鼠体内miRNA-24表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，干预组大鼠体内miRNA-24表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后1、5、10 d，与正常组比较，模型组及干预组大鼠Bim蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，干预组大鼠Bim蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论汉防己甲素可有效降低脊柱损伤模型大鼠miRNA-24的表达，提高Bim蛋白表达，是治疗脊柱损伤大鼠的有效药物。

汉防己甲素；脊柱损伤；大鼠模型；miRNA-24；Bim蛋白

脊柱损伤常由高处坠落、交通及建筑事故、自然灾害等外伤因素所致，严重时可引起脊髓损伤［1］。伤后患者表现为颈部或腰背部疼痛、脊柱活动受限、四肢感觉及运动障碍，重则呼吸困难、大小便失禁，严重影响患者的正常生活，甚至危及患者生命［2］。脊柱损伤容易发生二次损伤，如血管损伤、胸腔积液、肺损伤、脊髓神经损伤等。有数据显示［3］，脊柱损伤最为严重的并发症为脊髓损伤，在发达国家，脊髓损伤每年的发生率大约为13.3～45.9人／百万人，且呈逐年升高趋势。为了提高脊髓损伤患者的治疗效果，减少脊髓损伤等严重并发症的发生，国内外许多专家学者进行了大量研究。有研究显示［4］，miRNA-24是广泛存在于人体内的RNA，具有抑制细胞凋亡的作用，其含量的升高，说明细胞凋亡速度降低、消亡率下降，提示损伤组织不断愈合［5］；Bim蛋白是Bcl-2蛋白家族的成员，是一种促凋亡蛋白，主要作用是促使细胞凋亡，其含量的降低说明体内细胞凋亡减少，受损组织得到重建［6］。汉防己甲素，是一种抑制关节痛、风湿病、神经痛等疾病的有效药物，具有抗肿瘤及抗敏作用［7］，目前作为治疗脊柱损伤的药物，被各大医院所关注。为明确汉防己甲素治疗脊柱损伤的机制，本文对汉防己甲素对脊柱损伤模型大鼠miRNA-24和Bim蛋白表达的影响进行了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 114只健康成年SPF级雌性Wistar大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号0123008），体质量219～253 g。

1.2 主要试剂 汉防己甲素注射剂（海南制药厂有限公司制药二厂，国药准字H20066570）；miRNA-24 RT-PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；PCR反应试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；Bim兔抗大鼠多克隆抗体（美国Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组 将其分为3组，其中正常组35只，雄性12只，雌性23只，平均体质量（120.2±5.8）g；模型组36只，雄性22只，雌性14只，平均体质量（122.5±6.4）g；干预组43只，雄性28只，雌性15只，平均体质量（119.9±4.8）g。本实验遵循《实验动物管理条例》［8］，符合3R原则。3组大鼠饲养方式一致，体质量等一般资料差异无统计学意义。

1.3.2 模型制备 大鼠在温度、湿度等环境适宜的情况适应性喂养饲养1周。待大鼠适应环境后，参照《大鼠模型制备法》［9］，采用加速压迫型Allen's打击法对模型组及干预组大鼠进行脊柱损伤造模。

1.3.3 给药 3组小鼠在相同环境下饲养，干预组大鼠给予汉防己甲素注射剂，20mg／（kg·d），2周为1个疗程。治疗前后，分别采取大鼠空腹静脉血3mL，3500 r／min离心10min，选取上层澄清血清，于－67℃保温箱保存备用。采用Rt-PCR检测大鼠miRNA-24；采用Western blot检测Bim蛋白的表达。Ct值与miRNA-24表达呈正相关，Bim的平均灰度值与其表达呈正相关。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0进行统计学分析，正态计量数据用“±s”表示，正态资料组间比较采用t检验，计数资料进行χ2检验处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗后3组大鼠不同时段体内miRNA-24的Ct值比较 治疗后1、5、10 d，与正常组比较，模型组及干预组大鼠体内miRNA-24的Ct值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，干预组大鼠体内miRNA-24的Ct值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 治疗后3组大鼠不同时段体内miRNA-24的Ct值比较Tab.1 Comparison ofmiRNA-24 Ct value at different time after treatment in three groups

2.2 治疗后3组大鼠不同时段Bim平均灰度值比较 治疗后1、5、10 d，与正常组比较，模型组及干预组大鼠Bim平均灰度值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，干预组大鼠 Bim平均灰度值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2，图1）。

图1 3组大鼠Bim蛋白表达比较1，2：模型组；3，4，5：干预组；6，7，8：正常组Fig.1 Comparison of Bim protein expression in three groups1，2：Model group；3，4，5：Intervention group；6，7，8：Normal group

3 讨论

脊柱损伤多由交通事故、战争、自然灾害等导致，严重时可引起脊髓损伤。临床表现为脊柱活动受限、疼痛，严重时可导致脊髓损坏，造成运动感觉障碍，甚至二便不能自理。本病常易发生二次损伤、引起脊髓炎症等，严重影响患者生活质量，已成为当今社会较为严重的一类外伤性质的疾病，发病率极高。研究显示［10-14］，miRNA-24是人体内具有抑制细胞凋亡作用的一类RNA，其含量的降低，说明细胞凋亡加速，提示组织、神经等损伤严重；Bim蛋白是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，其表达升高表明细胞凋亡增加，组织损害严重。汉防己甲素，是治疗风湿病、神经痛的有效药物，具有一定的抗肿瘤及抗敏作用，其作为治疗脊柱损伤的新兴药物，已得到研究人员的广泛关注。为进一步探究汉防己甲素对脊柱损伤患者的治疗效果，本文采用Wistar大鼠构建了脊柱损伤模型。

本实验研究结果显示：治疗后1、5、10 d，与正常组比较，模型组及干预组大鼠体内miRNA-24的Ct值显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，干预组大鼠体内miRNA-24的Ct值显著降低（P＜0.05），与孟步亮等［14］实验结果一致。治疗后1、5、10 d，与正常组比较，模型组及干预组大鼠Bim平均灰度值显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，干预组大鼠Bim平均灰度值显著升高（P＜0.05），与王力等［15］实验结果一致。汉防己甲素是中药防己的有效成分，研究证明其具有抗炎、抗脂质过氧化、防止细胞受损、改善微循环及Ca2＋拮抗作用，可通过增加Bcl-2表达、降低bax表达，抑制急性脊髓损伤后神经细胞的凋亡，有益于脊髓组织的保护，促进运动功能的恢复，改善局部微环境［3］。

综上所述，汉防己甲素有明显抑制细胞凋亡的作用，可通过提高大鼠miRNA-24的含量，降低Bim蛋白表达来治疗脊柱损伤大鼠。

［1］罗春山，田晓滨，汪雷，等.汉防己甲素对大鼠急性脊髓损伤后bcl-2和bax表达的影响［J］.第三军医大学学报，2010，32（12）：1321-1324.

［2］王远政，田晓滨，李波，等.汉防己甲素对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡和相关基因表达的影响［J］.中华创伤杂志，2012，28（5）：460-465.

［3］罗春山.汉防己甲素对大鼠急性脊髓损伤后神经保护作用的机制研究［D］.重庆医科大学，2013.

［4］王冠.川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤中miRNA--24和Bim蛋白表达的影响［D］.中南大学，2013.

［5］周亚星，杨晓俊，徐泽宽，等.大鼠骨髓来源树突状细胞成熟过程中微小RNA表达谱变化［J］.中华实验外科杂志，2013，30（4）：703-706.

［6］张源.大鼠脊髓损伤后前凋亡蛋白Bim表达的改变及其意义［D］.中南大学，2010.

［7］禹晓东.嗅鞘细胞的培养及其生物学特性的实验研究［D］.第四军医大学，2010.

［8］郑文添，黄汉兴，王玮，等.Allen，S脊髓损伤大鼠模型评价［J］.中外健康文摘，2012，9（15）：88-90.

［9］秦慧慧，王文春，葛杜鹃，等.改良钳夹型脊髓损伤大鼠模型的建立及神经功能评价［J］.西南军医，2014（1）：1-4.

［10］陆海英，吕磊.丁酸钠对脊髓损伤大鼠模型的神经保护作用及机制［J］.临床神经病学杂志，2013，26（1）：35-37.

［11］李广盛，龙厚清，林尔坚，等.一种新型慢性压迫性颈髓损伤大鼠模型的建立［J］.中华显微外科杂志，2013，36（1）：46-51.

［12］赵东旭，袁洪萍，朱庆三，等.人参皂甙对大鼠脊髓损伤的实验研究［J］.中国实验诊断学，2009，13（1）：35-37.

［13］李昭成，王文己，张景贵，等.脊髓损伤后运动功能恢复中粒细胞集落刺激因子的作用［J］.中国组织工程研究，2013（40）：7110-7116.

［14］孟步亮，巴迎春，宋士娜，等.脊髓全横断大鼠模型的构建［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（7）：1215-1218.

［15］王力，孙丽，窦慧慧，等.大鼠新型挫伤型脊髓损伤模型的建立及评价［J］.神经解剖学杂志，2010，26（6）：638-642.

（编校：吴茜，刘路路）

Effect of tetrandrine on expression ofm iRNA-24 and Bim protein of spinal injury model rats

DENG Bi-quan1，HOU Tie-sheng2，FU Qiang2，HU Hua1，XIONG Jun1

（1.Deparment of Spine Surgery，Wuhan Central Hospital，Wuhan 430014，China；2.Department of Orthopedics，Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo investigate the effects of tetrandrine on expression of miRNA-24 and Bim protein of spinal injury model rats.Methods114Wistar ratswere selected and divided into three groups：35 rats in normal group，36 rats in model group，and 43 rats in intervention group.All rats were prepared for spinal cord injury models using accelerated oppressive Allen method except that in normal group.All ratswere fed in the same environment，rats in intervention group were given tetrandrine 20mg／（kg·d），twoweekswas one course of treatment.rats in other two group were given an equal volume of saline，After treatment，expression of miRNA-24 and Bim protein in three groups were compared respectively.ResultsCompared with normal group，the Ct values ofmiRNA-24 inmodel group and intervention group were significantly higher than normal group at 1，5 and 10 d after treatment，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；compared with model group，Ct value of miRNA-24 in intervention group was significantly lower than model group at1，5，10 d after treatment（P＜0.05）.Compared with normal group，the average gray values of Bim protein in model group and intervention group were significantly lower than model group at 1，5 and 10 d after treatment（P＜0.05）；compared withmodel group，the average gray value of Bim protein in intervention group was significantly higher thanmodelgroup at1，5 and 10 d after treatment（P＜0.05）.Conclusion Tetrandrine can effectively decrease miRNA-24 expression，increase Bim protein expression in spinal injury model rats，and it is effective to cure spinal injury rats.

tetrandrine；spinal injury；ratmodel；miRNA-24；Bim protein

R681.5

A

1005－1678（2014）08－0032－03

国家自然科学基金（30070762，30872629）

邓必权，男，博士，主治医师，研究方向：脊柱外科疾病，E-mail：dbiquandr＠126.com。