PICK 1抑制剂FSC231的镇痛作用研究

李铁军，郭小文

（1.中国医科大学附属第四医院麻醉科，辽宁建平110032；2.浙江省中医院麻醉科，浙江杭州310006）

PICK 1抑制剂FSC231的镇痛作用研究

李铁军1，郭小文2

（1.中国医科大学附属第四医院麻醉科，辽宁建平110032；2.浙江省中医院麻醉科，浙江杭州310006）

目的研究蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（protein interacting with Cαkinase 1，PICK1）抑制剂FSC231的镇痛作用，为开发可用于临床疼痛治疗的PICK1抑制剂提供依据。方法选用40只昆明种小鼠分别于右后掌皮下注射1.4%醋酸溶液、腹腔注射0.6%醋酸溶液制备醋酸致痛模型、左侧足趾注射20μL完全弗氏佐剂（CFA）溶液制备炎症性疼痛模型，左后足趾注射辣椒素溶液制备神经源性疼痛模型。将以上实验动物随机分为4组：对照组和FSC231 3个剂量给药组，每组10只。FSC231 3个剂量给药组分别于造模成功后腹腔注射FSC231 7.83、39.20、78.40μg／kg，给药1次。对照组动物注射等体积的生理盐水。给药1 h后，分别测定小鼠后掌抬腿次数、抑制率、小鼠扭体反应次数、潜伏期、小鼠热痛阈值、脚爪肿胀体积，热缩足反射潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）和机械痛阈值。结果与对照组比较，FSC231可剂量依赖性（7.83～78.40）μg／kg减少小鼠5min内抬腿次数和6～10min内抬腿次数，6～10min内抑制率分别为18.74%、32.59%和45.52%；与对照组比，不同剂量FSC231均可一定程度延长小鼠的致痛潜伏期，但仅高剂量组小鼠的镇痛潜伏期有显著增加（P＜0.05）；FSC231可剂量依赖性（7.83～78.40）μg／kg减少小鼠的扭体反应次数，其中以高剂量组的作用最为显著（P＜0.01）。左侧足趾注射完全弗氏佐剂（CFA）溶液后，小鼠出现舔患足，且患足出现红、肿等现象，表明成功制备了小鼠慢性炎性疼痛模型。给予不同剂量的FSC231后，给药组基础痛阈值较对照组显著升高（P＜0.05），但后肢足肿胀体积显著增加（P＜0.05）。小鼠左后足趾注射辣椒素后其热缩足反射潜伏期（TWL）和机械痛阈值明显降低，表明成功制备神经病理性疼痛模型。FSC231可剂量依赖性（7.83～78.40μg／kg）升高TWL及机械痛阈值（P＜0.05，P＜0.01）。结论PICK1抑制剂FSC231对化学刺激性疼痛、炎症性疼痛以及神经源性疼痛均具有明显镇痛作用，表明PICK1可作为镇痛作用的新靶点，而PICK1抑制剂FSC231可作为镇痛作用的候选药物。

PICK1；镇痛；完全弗氏佐剂；FSC231

蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（protein interacting with Cα kinase 1，PICK1）广泛分布在人和动物的组织细胞内，其PDZ结构域与BAR结构域能够与多种蛋白质相互作用，形成一个蛋白募集结构，募集多种蛋白趋向特定部位，从而参与多种细胞功能的调节以及信号转导，PICK1参与如疼痛、精神分裂症、帕金森综合症、癌症等疾病的发生，在上述疾病中扮演重要角色［1］。目前PICK1在这些疾病发生过程中的确切作用机制还不清楚，但是自1995年被发现以来，已报道其能与40多种蛋白发生作用，并执行诸多功能。利用某些小分子化合物或者多肽可以特异性地调节PICK1与其特异性配体蛋白的相互作用，从而为研究治疗与这些配体相关蛋白的疾病提供了研究思路［2-5］。本课题采用醋酸致痛小鼠模型、完全弗氏佐剂致炎症性疼痛模型、辣椒素溶液致神经源性疼痛模型，观察醋酸经足底注射、经腹腔注射后小鼠疼痛行为学的变化；完全弗氏佐剂经足底注射后热痛阈以及炎症反应的变化；辣椒素经足底注射后TWL和机械痛阈值的变化。在确认模型制备成功后，比较不同剂量的PICK1特异性抑制剂FSC231经小鼠腹腔注射给药后的疼痛行为学变化，观察不同剂量的FSC231对上述致痛模型动物镇痛作用效果，为开发可用于临床疼痛治疗的PICK1抑制剂提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物：清洁级健康昆明种小鼠，雄性，体质量25～30 g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号SCXK（鄂）2008－0005。动物室饲养温度（23±2）℃、湿度50%～60%、人工光照明暗各12 h，标准饲料喂养。

1.1.2 主要药品与试剂：FSC231（德国默克，分子量313.14，CAT529531），先用DMSO将FSC231配成10mM的储存液，再根据需要加入适量的生理盐水将FSC231配制成1.57、7.85、15.70μg／mL的溶液，避光冷藏待用；冰醋酸（密度1.05 g／mL，质量体积分数99.7%，国药集团化学试剂有限公司），实验前分别用蒸馏水将冰醋酸配制成1.4%、0.6%的醋酸溶液，避光保存于棕色试剂瓶中待用；

完全弗氏佐剂（CFA，Sigma试剂公司）；辣椒素（TOCRIS公司，用无水乙醇、Tween 80、生理盐水按1∶1∶8比例配成溶剂，以此溶剂溶解辣椒素粉配成33mM的辣椒素溶液）；注射用生理盐水（四川科伦药业股份有限公司，每瓶500 mL）；三蒸水，实验室自制。

1.1.3 仪器：1096AF超声波清洗仪（宁波荣顺科技仪器厂）；微量加样器（Eppendorf，德国）；电子分析天平（AEL-200型，湘仪天平仪器厂）；秒表（504型，北京华运安特科技有限责任公司）；PL-200热刺痛仪（成都泰盟科技有限公司）；PV-200足趾容积测定仪（成都泰盟科技有限公司）；RB-200智能热板仪（上海益联科教设备有限公司）；VONFREY测痛仪（法国Bioseb公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模：40只健康雄性昆明小鼠，随机分为以下4组：FSC231低、中、高剂量组和对照组。3个给药组分别腹腔注射FSC231 7.83、39.20、78.40μg／kg，1 h后在小鼠右后掌皮下注射1.4%醋酸溶液10μL，立即放入实验观察盒中观察注射后5min内及6～10min内小鼠注射侧右后掌的抬腿次数。对照组腹腔注射生理盐水1 h后，在小鼠右后掌皮下注射1.4%醋酸溶液10μL，也立即放入实验观察盒中观察注射后5min内及6～10min内小鼠注射侧右后掌的抬腿次数。在实验前3 d，每天将小鼠静置于1000mL烧杯中0.5 h，使其在实验烧杯里适应。室温控制在23℃，湿度50%～60%，保证室内充足光照，实验时间控制在8：00～18：00。

1.2.2 指标检测：FSC231对醋酸致痛小鼠自发缩足反射的影响：观察注射后5min内及6～10 min内小鼠注射侧右后掌抬腿次数，计算小鼠舔咬抑制率，其计算公式如下［6］：抑制率＝（对照组平均缩足次数－FSC231组平均缩足次数）／对照组平均缩足次数×100%。

FSC231对醋酸致痛小鼠扭体反应的影响：观察注射醋酸后小鼠第1次开始出现扭体的时间（潜伏期），当小鼠出现典型的腹部内凹，同时伴有躯干扭曲，臀部抬高以及后肢伸长等特征性反应时，认为是一次扭体的发生［7］，再一直持续观察小鼠扭体的发生，记录从第1次出现扭体反应后的15min内小鼠出现扭体的总次数［8］。

FSC231对慢性炎性疼痛的影响：观察小鼠的精神状态及其左后足的变化（如红、肿情况，足底注射处是否有渗液或感染等），采用PL-200热刺痛仪测量小鼠的热痛阈值；用PV-200足趾容积测定仪测量其左足的体积，记录相关数据［9］。

FSC231对辣椒素致小鼠神经病理性疼痛热痛阈和机械痛阈的影响：将实验小鼠置于玻璃圆柱罩中，圆柱罩下为凿孔工作台。待小鼠适应环境后，以VonFrey纤维刺激小鼠注射辣椒素侧足底，从细至粗，每种型号刺激针刺激10次，每次间隔5 s。小鼠会出现抬足和缩足等反应。当VonFrey纤毛针曲成90°时小鼠仍不抬足，判断小鼠对此纤维无反应。以出现5次以上缩足反应为阳性，记录能够引发缩足反应的最小力度为机械性痛阈（g）。于注射辣椒素之前以及注射辣椒素之后的0.5 h测定每组小鼠后足的机械性痛阈［10］。

2 结果

2.1 FSC231对醋酸致痛小鼠自发缩足反射影响 与对照组比较，FSC231可剂量依赖性（7.83～78.40）μg／kg减少小鼠5 min内抬腿次数和6～10min内抬腿次数，6～10min内抑制率分别为18.74%、32.59%和45.52%（见表1）。

表1 FSC231对醋酸致痛小鼠自发缩足反射影响Tab.1 Effect of FSC231 on acetic acid induced pain in mice spontaneous flinching reflex

2.2 FSC231对醋酸致痛小鼠扭体反应的影响 不同剂量的FSC231均可一定程度延长小鼠的致痛潜伏期，但与对照组相比，仅高剂量组小鼠的镇痛潜伏期有显著增加（P＜0.05）。FSC231可剂量（7.83～78.4）μg／kg依赖性减少小鼠的扭体反应次数，其中以高剂量组的作用最强（见表2）。

表2 FSC231对醋酸致痛小鼠扭体反应的影响Tab.2 Effect of FSC231 on writhing reaction ofmice with pain induced by acetic acid

2.3 FSC231对慢性炎性疼痛的影响 小鼠给予CFA后，尽管其毛发、饮食和自主活动均正常，但实验过程中发现小鼠经常舔患足，且多数小鼠注射肢均出现红、肿等现象，且模型对照组小鼠在给予CFA后基础痛阈值显著降低，后肢肿胀体积显著增大，表明在给予CFA后成功制备了小鼠慢性炎性疼痛模型。与模型对照组相比，FSC231可剂量（7.83～78.4）μg／kg依赖性升高小鼠的基础痛阈值，但不同剂量的FSC231均不能显著改善小鼠的后肢肿胀体积，反而会显著增加小鼠的后肢体积（见表3）。

表3 FSC231对CFA诱导的小鼠基础痛阈和后肢体积改变的影响Tab.3 Effect of FSC231 on pain threshold and hind limb volume ofmicemodel induced by CFA

2.4 FSC231对辣椒素致小鼠神经病理性疼痛热痛阈和机械痛阈的影响结果 小鼠给予辣椒素后，尽管其毛发、饮食和自主活动均正常，但热缩足反射潜伏期（TWL）和机械痛阈值显著降低，表明成功制备神经病理性疼痛模型。给予FSC231后，辣椒素诱导的TWL和机械痛阈值下降均有不同程度的升高，其中以高剂量组升高最为显著（见表4）。

表4 FSC231对辣椒素致小鼠神经病理性疼痛热痛阈和机械痛阈的影响Tab.4 Effect of FSC231 on neuropathic pain mice capsaicin induced heat and mechanical pain sensitivity

3 讨论

醋酸致痛小鼠自发缩足反射实验是一个简便可靠的评价药物镇痛作用的方法，适用于外周镇痛实验的研究［11］。本实验结果显示，无论在0～5min还是6～10min内，FSC231不同剂量组均能够显著减少小鼠自发缩足反射次数，与对照组差异显著，表明PICK1的特异性抑制剂FSC231具有显著的外周镇痛作用。同时我们也发现，FSC231的外周镇痛作用呈现较明显的剂量依赖性特征，随着给药剂量的增加，缩足反射的抑制率显著增加，表明其镇痛作用越明显。

小鼠醋酸扭体实验是通过腹腔注射一定浓度的醋酸刺激，引起小鼠腹膜剧烈化学性刺激而产生疼痛，小鼠行为表现为扭体反应。这种伤害性反应可能由于注射醋酸后，小鼠腹腔pH值过低而刺激伤害性传入神经纤维和炎症递质合成共同作用所导致［12］。向小白鼠腹腔内注入化学刺激物可引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小白鼠产生“扭体”反应，如腹部内凹（呈蜂腰状）、躯干与后腿伸张、臀部高起等。常用镇痛药均对此有抑制作用，可明显减少发生“扭体”反应的小鼠数［13］。通过观察记录小鼠的扭体反应，可评价受试药物的镇痛作用［14］。在该实验中，小鼠已经表现出上述体征，说明腹腔注射制备的醋酸致疼痛模型是成功的。实验结果显示，不同给药剂量的FSC231能够明显减少经醋酸致痛模型小鼠的扭体次数，其中高剂量组的作用最为显著（P＜0.01），同时还能够一定程度上延长小鼠镇痛潜伏期，增强小鼠对痛觉的耐受力。

目前针对PICK1蛋白为靶点的药物筛选工作已经成为药理研究工作中的一个热点，现阶段主要是针对PDZ结构域采用蛋白质相互作用结构域结合配体的方法筛选相关的阻断性多肽，例如采用酵母双杂交系统、定向随机肽库、定向随机肽库蛋白芯片、噬菌体展示以及时间分荧光共振能量转移法筛选目的多肽［15］。通过筛选得到的小分子多肽与PICK1的PDZ结构域特异性结合，干扰PICK1生理过程中与配体蛋白的作用，从而发挥特定的药用目的。PICK1的另外一个重要的结构域——BAR结构域如何参加PICK1的生理调节的过程研究得比较少，其分子机制有待于进一步研究。

［1］Morita K，Morioka N，Abdin J，et al.Development of tactile allodynia and thermal hyperalgesia by intrathecally administered plateletactivating factor in mice［J］.Pain，2004，111（3）：351-359.

［2］胡壮丽.PICK1基因敲除对炎性疼痛的作用及相关机制［D］.武汉：华中科技大学.2008.

［3］赵欣，于布为.疼痛机制研究进展［J］.上海医学，2007，30（6）：462-465.

［4］Tao YX，Johns RA.PDZ domains at excitatory synapses：potential molecular targets for persistent pain treatment［J］.Curr Neuropharmacol，2006，4（6）：217-223.

［5］Forrer M，Hamilton AC，Lnglese JA.PDZ domain-based detection system for enzymatic assays［J］.Anal Bioehem，2002，301（2）：207-216.

［6］Fuh G，Pisabarre MT，Li Y，et al.Analysis of PDZ domain-ligand interactions using carboxyl-terminal phase display［J］.J Bid Chem，2000，275（28）：21486-21491.

［7］Huang LJ，Yoon MH，Choi JI，et al.Effect of sildenafil on neuropathic pain and hemodynamics in rats［J］.Yonsei Med J，2010，51（1）：82-87.

［8］Midtgaard.PDZ Scaffolding Proteins-A case study of PICK1［J］. Molecular Neuropharmacology，2013，47（3）：745-749.

［9］RedriguezM，Li SS，Harper JW，etal.An oriented peptide array library（OPAL）strategy to study protein-protein interactions［J］.J Biol Chem，2004，279（10）：8802-8807.

［10］郑贵超，王月静，张莉.锌预处理对辣椒素致痛模型小鼠行为学变化的影响［J］.辽宁医学院学报，2013，34（2）：11-13.

［11］Thorsen TS，Madsen KL，Rebola N，et al.Identification of a smallmolecule inhibitor of the PICK1 PDZ domain that inhibits hippocampal LTP and LTD［J］.Pains，2010，107（1）：413-418.

［12］Yan LD，Liu YL，Zhang L，et al.Spinal antinociception of synthetic omegaconotoxin SO-3，a selective N-type neuronal voltage-sensitive calcium channel blocker，and its effects on morphine analgesia in chemical stimulus tests in rodent［J］.Eur JPharmacol，2010，13（6）：73-81.

［13］徐淑云，卞如濂，陈修.药理学实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：882-883.

［14］Garrye M，MossA，Rosie R，et al.Specific involvement in neuropathic pain of AMPA receptorsand adapter proteins for the GluR2 subunit［J］. Mol Cell Neurosci，2003，24（1）：10-22.

［15］Redriguez M，Li SS，Harper JW，et al.An oriented peptide array library（OPAL）strategy to study protein-protein interactions［J］.J Biol Chem，2004，279（10）：8802-8807.

（编校：吴茜）

Effect of FSC231，an inhibitor of PICK1 on analgesia in m ice

LITie-jun1，GUO Xiao-wen2

（1.Department of Anesthesiology，The Fourth Hospital Affiliated to China Medical University，Jianping 110032，China；2.Department of Anesthesiology，Chinese Medicine Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310006，China）

ObjectiveTo investigate the pharmacological effects of FSC231，the inhibitor of PICK1 through the establishment of acetic acid induced pain model，inflammatory pain model and neuropathic pain model and provide foundation in treatment of clinical pain.Methods40 Kunming miceswere randomly divided into four groups，after the adaptive feeding for a week，and injected 1.4%acetic acid solution in the right hind paw of mice，intraperitoneally of0.6%acetic acid solution in left toe ofmice to prepare acetic acid-induced pain model，injected 20μL complete Freund's adjuvant（CFA）of left toe to prepare inflammatory pain model，injected capsaicin solution of left rear toe to prepare neuropathic pain model：control group and 7.83，39.2，78.4μg／kg FSC231 groups，indictors such as counting palm leg raise times，the inhibition rate，writhing response，incubation period，heat pain threshold，paw swelling volume，the value of TWL and mechanical pain threshold were evaluated after 1h.ResultsCompared with control group，FSC231 could reduce the number of leg raise ofmice with dose-dependentmanner（7.83-78.40）μg／kg in 5min and the number in 6-10 min，and the inhibition rates in 6-10min were 18.74%，32.59%and 45.52%.Compared with control group，different doses of FSC231 could prolong the pain incubation period，butonly the high-dose group's analgesic incubation period were increased significantly（P＜0.05）；FSC231 could reduce the number ofwrithing responses in mice with dose-dependent manner（7.83-78.40）μg／kg，in which the effects of high dose group were the most significant（P＜0.01）.In inflammatory pain models，each rat often lick its affected feet，the majority of affected feet appeared redness，swelling and other inflammatory performance，which showed that inflammatory painmodelswere successfulmade up.After given CFA，the basal pain thresholdswere significantly higher than those of control group（P＜0.05），but the swollen volume of hind legs increased significantly（P＜0.05）.After injected with capsaicin solution in the left hind digit，the TWL and mechanical pain threshold significantly decreased，which showed that neuropathy pain modelweresuccessful prepared.FSC231 could rise TWL and themechanical pain threshold（P＜0.05，P＜0.01）with dose dependentmanner（7.83-78.40μg／kg）.Conclusion FSC231 has obviousanalgesic effect including neuropathic pain，inflammatory pain，and chemical irritation pain.These results suggest that PICK1 plays an important role in inflammatory pain and neuropathic pain.It is a new target for pain relief，suggesting that PICK1 is an important analgesic drug targets.

PICK1；analgesia；CFA；FSC231

R285

A

1005－1678（2014）08－0015－04

2012年浙江省医药卫生一般研究计划（2012KYA141）

李铁军，男，本科，主治医师，研究方向：临床麻醉，E-mail：litjun0517＠163.com。