CIK细胞治疗晚期大肠癌的临床研究

方慧云 程伟民 李晓玲 季明芳

大肠癌(colorectal cancer，CRC)包括结肠癌和直肠癌，是常见的消化道恶性肿瘤之一，全世界大肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第三位[1-2]。目前主要是手术、放疗和化疗，但是这些方法对于晚期患者效果并不理想。随着分子生物学及基因工程技术的不断发展，CIK细胞过继免疫治疗已成为肿瘤治疗的第四模式。本研究是将CIK细胞行体外诱导培养后，回输患者体内，并随机抽出30例未行CIK治疗的晚期大肠癌患者，进行比较，观察其疗效。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集经确诊的、并发生转移的、且采用标准治疗方案(手术、放疗和化疗)治疗的晚期大肠癌患者作为观察组(30例)，取其外周血分离单个核细胞(PBMC)，体外细胞因子诱导培养CIK细胞，应用流式细胞仪检测细胞表型，30例患者均接受CIK细胞免疫治疗，观察其免疫活性、无进展生存期及生存期。以30例仅采用标准治疗方案而未经CIK治疗的晚期大肠癌患者作为对照组。两组性别、年龄无显著差异。

1.2 试剂

GT-T551无血清培养基购自TaKaRa生物技术有限公司，培养用IL-2、CD3McAb、IL-1、IFN-γ均为R&D公司产品，流式细胞仪标记抗体CD3、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+为BeckmanCoulter产品。

1.3 细胞培养和诱导

CIK细胞的体外诱导和扩增：采集患者外周血50ml，用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离出PBMNC，GT-T551无血清培养基调细胞浓度为(4 - 6 )×106/ml，并加入1 000 U /ml的IFN-γ悬浮培养，培养液15 ml，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后加入1 μg/ml的CD3单克隆抗体和1 000 U /ml的IL-1，48 h后补加液至50 ml，补充CD3单克隆抗体。第4天继续补加液至80 ml，培养第5天分成3瓶，第7天转移至培养袋，每2天加液1次，液量为500 ml。

1.4 流式细胞仪检测

待细胞培养15天后，应用流式细胞仪检测CIK细胞表面分子，CIK细胞是以CD3、CD4、CD8细胞为主的异质性细胞，CD3 和CD8细胞百分率随培养时间的延长而增高，CD3分辨率>80%，CD3+CD56+分辨率>20%。

1.5 治疗方法

细胞培养第15天开始回输患者体内，细胞分5次回输，细胞总量不少于1010。输注过程中要严格按照无菌操作程序，冲洗输液管道的盐水量不必太多，输前口服消炎痛，出现发热寒战等症状应停止回输，并采取应对措施。

1.6 免疫指标的检测

观察组患者在治疗前后检测外周血T淋巴细胞亚群(CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+，CD3+CD56+)和NK细胞(CD56+)变化。

1.7 毒性反应监测

观察组患者在每次治疗后6 h内观察包括(过敏反应和变态反应等急性毒性反应)；每2周检查患者血常规、肝肾功能，以观察治疗的慢性毒性反应。

1.8 随访项目

观察两组患者无进展生存期及生存期。

1.9 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 CIK细胞回输后不良反应

3例患者有轻度畏寒、发热等症状，体温37.5～38 ℃，一般回输1～2 h后出现，历时2～6 h，可自限性。

2.2 CIK细胞治疗后外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞变化

CIK细胞治疗后，发现CD3+、CD3+CD4+、CD56+(NK)效应细胞的比率和CD4+/ CD8+比值显著上升，而CD3+CD56+效应细胞的比率下降，见表1。

表1 CIK细胞治疗前后T淋巴细胞亚群及NK细胞水平

2.3 预后

观察组发生转移后无进展生存期为(50.9±10.8)个月，对照组无进展生存期为(26±8.3)个月，差异有统计学意义(P<0.05)。

观察组发生转移后生存期为(62.5±13.8)个月，对照组为(35.6±10.2)个月，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

我国大肠癌发病率呈逐年上升趋势，尤其是结肠癌的发病率迅速上升。大多数患者就诊时已达中晚期，采用标准治疗方案已没有明显效果。CIK细胞是1种新型的免疫活性细胞。它是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞[3-4]，具有增值速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高等优点；配合化疗、放疗，可提高肿瘤患者对放化疗的耐受性，提高肿瘤的治疗效果；晚期肿瘤患者单纯采用CIK治疗，可以消除、减小肿瘤，提高免疫力和患者生存率以及生活质量。

CIK细胞是多种细胞因子共同诱导培养的细胞，多种细胞因子的作用是相互协同，单一薪资对效应细胞的增殖及细胞毒活性小于多种细胞因子的联合作用。抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)作为1种有丝分裂促进剂可促进细胞增殖，具有抗肿瘤转移的作用。γ-干扰素(IFN-γ)可通过多种途径直接或间接发挥抗肿瘤作用。在诱导CIK细胞形成过程中加入IFN-γ可降低IL-2用量，且先加入IFN-γ后加入IL-1可提高细胞毒活性，因为先加入IFN-γ可促使PBMC上IL-2受

体数量增加，从而有效地激活效应细胞。白细胞介素-1(IL-1)主要由激活的单核巨噬细胞产生，它可以介导外周单个核细胞上表达IL-2受体，与IFN-γ、CD3McAb合用时可以明显提高CIK的细胞毒效应，但IL-1对CIK扩增不起作用[5]。白细胞介素-2(IL-2)是T淋巴细胞分泌的1种细胞因子，具有免疫增强、抗肿瘤和抗感染的作用。

CIK细胞杀伤靶细胞的机制：与靶细胞的结合阶段，通过靶细胞表面分子和效应细胞表面的受体相结合；致死性打击阶段，CIK细胞激活后释放毒性颗粒和分泌细胞因子，从而导致肿瘤细胞的裂解；靶细胞溶解阶段。本研究结果显示，30例晚期大肠癌患者通过CIK 治疗后，免疫功能增强，无进展生存期及生存期延长。目前，晚期大肠癌患者在接受标准治疗后，联合细胞免疫治疗，可缓解病情，改善患者的生存质量，提高生存率。

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