Celecoxib对放射所致DNA损伤修复与凋亡的影响

雷宏伟 龙 成 姜永梅 佟恩娟 滕 云 李国权

环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin，PG)的限速酶，其亚型COX-2在多数恶性肿瘤中呈过度表达并与肿瘤预后密切相关[1-2]。已有研究表明COX-2的过度表达与放疗抵抗正相关。选择性COX-2抑制剂不仅具有抗肿瘤活性[3]，还有放疗增敏效应[4]，但其放射增敏机制还未明确。本实验采用人肺腺癌A549细胞株，观察选择性COX-2抑制剂celecoxib对放射引起凋亡和DNA损伤修复的影响，进一步探讨celecoxib的放疗增敏机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人肺腺癌A549细胞系购自本院中心实验室。Celecoxib购自大连美仑生物技术公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自日本同仁化学研究所。引物序列、DNA Maeker及RT-PCR试剂盒购自TaKaRa宝生物工程有限公司。医用直线加速器(美国Varian公司)；FACSCalibur 流式细胞仪(美国BD公司)；ΜVP(CA91786)凝胶成像分析系统(美国GENE公司)；核酸蛋白定量仪(德国Eppendorf公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及处理 将A549细胞置于RPMI 1640培养基，37℃、5% CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化、分离、传代。将细胞分为对照组(给相同体积的DMSO)、药物组(celecoxib)、照射组(6MV X射线6 Gy)、联合组〔celecoxib+6 GyX射线(药物作用24 h后)〕，离心收集对数生长期A549细胞，分别种植于96孔板和6孔板中，细胞密度分别为6000细胞/孔和2.5×105细胞/孔。照射方法：医用直线加速器，剂量率200 cGy /min，源皮距100 cm。

1.2.2 CCK-8法检测celecoxib的增殖抑制作用、IC50值及确定放疗增敏剂量 取对数生长期的A549细胞按每孔6×103个细胞接种于96孔培养板(100 μl/每孔)。加入不同浓度的celecoxib培养液100 μl，设置5个浓度梯度(10～160 μmol/L)，培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8液10 μL，继续培养1 h，酶标仪在550 nm处测定各孔吸光度值(A)，实验重复3次。细胞对照组是A549细胞及培养液，空白对照组为等体积包含DMSO的培养液。公式为：①肿瘤细胞存活率(%)=〔(加药组A值-空白对照组A值)/(细胞对照组A值-空白对照组A值)〕×100%；②肿瘤细胞抑制率(%)=1-肿瘤细胞存活率(%)。

1.2.3 半定量RT-PCR 取对数生长期的A549细胞根据实验分组进行处理，celecoxib作用48 h后收获细胞，按说明书完成RNA提取纯化、cDNA的合成及PCR扩增。DNA-PKcs上游引物5'-ATCTCTTAAAGCGGGCCTTCG-3'，下游引物5'-AGGCATCAACTCA GGGACTGG-3'，退火温度58℃，扩增产物239bp。Ku80上游引物5'-TATGCTCCCACCGAGGCACAGTTGA-3'，下游引物5'-ACTGCCTTCAGCCAGACTGGAGACG-3'，退火温度56℃，扩增产物478 bp[5]；GAPDH上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物5'-ATGGTGGTGAAGACG CCAGT-3'，退火温度56℃，扩增产物416 bp。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外灯下观察拍照。应用quantity one电泳图片分析软件分析，目的基因和GAPDH的灰度比值表示mRNA相对表达量。

1.2.4 Western blot实验 取对数生长期的A549细胞根据实验分组进行处理，celecoxib作用48 h后收获细胞，4℃PBS 液洗3遍，细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，用6%、12%的分离胶做SDS-PAGE，转移至NC膜上，用5%脱脂奶TBST室温封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次(每次10 min)，室温下辣根过氧化物酶二抗孵育1.5 h，TBST洗涤3次(每次10 min)，ECL曝光试剂盒曝光显影。扫描Western Blot蛋白条带，应用ImageMasterTM 2D Platinum软件分析灰度。目的蛋白与GAPDH的灰度比值表示蛋白相对表达量。

1.2.5 流式细胞仪检测凋亡率 取对数生长期的A549细胞分别根据实验分组进行相应处理，celecoxib作用48 h后收获细胞，胰酶消化，加1640培养液，取105个细胞，固定染色，应用流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析

所有实验均重复3次，采用t检验和方差分析分析组间和组内数据，数据分析应用SPSS 17.0软件。

2 结果

2.1 Celecoxib对A549细胞增殖抑制作用及IC50值

不同浓度的celecoxib作用于A549细胞，对细胞增殖均有抑制作用，随celecoxib浓度及作用时间的逐渐增加，细胞抑制率逐渐增高(P<0.01)，见表1。Celecoxib作用A549细胞48 h的IC01值为18.44 μmol/L，IC50值为58.74 μmol/L。取IC01值，即18.44 μmol/L作为后续实验的放疗增敏剂量。

表1 Celecoxib对A549细胞增殖抑制作用

2.2 Celecoxib联合照射对A549细胞DNA-PKcs和Ku80mRNA表达的影响

DNA-PKcs mRNA表达：对照组(1.411±0.044)，药物组(1.222±0.165)，照射组(1.632±0.055)，联合组(0.588±0.05)。与对照组相比，照射组表达量升高(P<0.05)，药物组表达量较对照组下降(P<0.05)，联合组表达量较其余3组均明显下降(P均﹤0.01)。Ku80mRNA表达：对照组(0.611±0.046)，药物组(0.553±0.012)，照射组(0.662±0.018)，联合组(0.301±0.016)。与对照组相比，照射组表达量升高(P<0.05)，药物组表达量较对照组下降(P<0.05)，联合组表达量较其余3组均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。结果提示放射可诱导DNA-PKcs和Ku80在mRNA水平表达增强，而celecoxib可显著抑制放射诱导的DNA-PKcs和Ku80RNA表达。

2.3 Celecoxib联合照射对A549细胞DNA-PKcs和Ku80蛋白的影响

DNA-PKcs蛋白表达：对照组(1.570±0.436)，药物组(1.492±0.045)，照射组(1.858±0.021)，联合组(1.195±0.025)。与对照组相比，照射组表达量升高(P<0.01)，药物组表达量较对照组下降(P<0.05)，联合组表达量较其余3组均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。Ku80蛋白表达：对照组(1.504±0.020)，药物组(1.454±0.018)，照射组(1.996±0.016)，联合组(1.240±0.0314)。与对照组相比，照射组表达量升高(P<0.01)，药物组表达量较对照组下降(P<0.05)，联合组表达量较其余3组均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。结果提示放射可诱导DNA-PKcs和Ku80在蛋白表达水平增高，而celecoxib可抑制放射诱导的DNA-PKcs、Ku80蛋白和RNA表达。

1、2、3、4分别代表对照组、药物组、照射组、联合组

2.4 Celecoxib联合照射对A549细胞凋亡的影响

对照组、药物组、照射组、联合组凋亡率分别为(2.11±0.05)%、(4.72±0.09)%、(9.80±0.05)%、(11.95±0.04)%，照射组、药物组凋亡率高于对照组(P<0.01)，联合组凋亡率明显高于其余3组，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

研究证实应用COX-2抑制剂能有效减少患恶性肿瘤的风险并抑制肿瘤形成的进程[6]。Celecoxib是选择性COX-2的抑制剂，已在多项实验中表现肿瘤细胞增殖抑制作用。本实验研究显示celecoxib对A549细胞具有增殖抑制作用，且随药物剂量、作用时间的增加而升高。

DNA双链断裂(DNA double strand breaks，DSBs)是电离辐射引起细胞死亡的主要原因之一，在哺乳类细胞中，非同源末端结合重组(DNA nonhomologous end-joining，NHEJ)是DSBs损伤修复中最重要的一种方式，DNA-PKcs、Ku70、Ku80等因子参与NHEJ修复。DNA-PK由DNA-PKcs和Ku组成，在辐射诱导的NHEJ修复中起到核心作用，其功能的丧失可导致细胞DSBs损伤修复能力的降低，使细胞对电离辐射的敏感性增高。已有研究提示放射线可引起胶质母细胞DNA-PKcs蛋白的升高[7]，而DNA-PK的高表达是放疗抵抗的可能机制之一，因此DNA-PK是放射增敏的潜在新靶点。有研究应用siRNA的方法敲除Ku80的基因，发现Ku80表达阴性的宫颈癌细胞对电离辐射的敏感性增高[8]。Ku80低表达的非小细胞肺癌患者预后及治疗效果明显好于Ku80高表达者[9]。Ku70低表达的肿瘤细胞对放射线更敏感，因此可以通过Ku70蛋白的表达水平来预测放疗疗效和局部控制率[10]。本实验研究发现照射组DNA-PKcs、Ku80的mRNA、蛋白表达均高于对照组，而联合组DNA-PKcs、Ku80的mRNA、蛋白表达均比其它各组降低，提示celecoxib联合照射可降低DNA-PKcs、Ku80的表达，故COX-2可能是影响DNA损伤修复因子的上游调节因子之一，celecoxib可通过抑制放射诱导的DNA损伤修复蛋白表达从而起到放疗增敏作用。

放射线导致的不能被修复的DNA损伤激活凋亡相关基因，诱导细胞凋亡。DNA-PK是感受DNA损伤的分子探测器，它的高表达可抑制细胞凋亡[11]。利用siRNA方法抑制DNA-PK的转录，或者利用抑制剂直接抑制其蛋白表达，均可以减少DNA损伤修复和诱导凋亡[12-13]。本实验结果显示，celecoxib联合照射抑制DNA-PKcs表达的同时，促进了细胞的凋亡。进一步证明，DNA-PKcs对细胞凋亡的作用。

综上所述，选择性COX-2抑制剂celecoxib对肺腺癌A549细胞具有放射增敏的作用，其作用可能通过抑制DNA-PKcs及ku80的表达，减少DNA损伤修复及促进放射诱导的凋亡的途径实现。但深入的分子机制还有待进一步研究。

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