15-脱氧前列素2抑制MG63细胞活性并诱导其凋亡的机制

全碧波 张善锋 李月白 李晓坤 李啸然 李 洁

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 郑州 450001)

骨肉瘤是骨组织最常见的原发性恶性肿瘤，约占所有骨肿瘤的20%。典型的恶性骨肉瘤具有显著地局部侵袭性和早期迁徙能力〔1〕，由于其转移病症较难诊断，通常该病患死亡率较高。过氧化物酶体增殖因子活化受体(PPAR)γ的激动剂能诱导多种肿瘤细胞凋亡或分化，其作为人类癌症的化学预防剂的潜在用途是目前研究的热点〔2〕。本研究分析PPARγ激动剂15-脱氧前列素2(15d-PGJ2)对人骨肉瘤MG63细胞增殖和凋亡的影响，探讨其抗肿瘤的作用机制。

1 材料和方法

1.1材料 人骨肉瘤细胞株MG63(北京协和细胞资源中心)；15d-PGJ2(美国Cayman公司)；胎牛血清(PAA公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；MTT、DMSO(美国Sigma公司)； RPMI 1640培养液(北京索莱宝科技有限公司)；DEPC(加拿大Fermentas公司)；AnnexinV-FITC试剂盒(南京凯基公司)；PCR扩增试剂盒 (加拿大Fermentas公司)；SP法免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥)；其余试剂均为国产分析纯。

1.2细胞培养 常规细胞复苏、换液和传代，倒置相差显微镜观察骨肉瘤MG63细胞的生长情况及形态学特征，取生长状态良好的骨肉瘤细胞描记细胞生长曲线。

1.3实验分组 以人骨肉瘤MG63细胞为作用对象，分为：对照组，不添加任何药物；15d-PGJ2组，根据实验加入其终浓度分别为0.1、1、5、10、20、50 μmol/L的15d-PGJ2。

1.4MTT法检测细胞增殖活力 取对数生长期MG63细胞，以3×104/ml细胞浓度，接种96孔培养板，每孔200 μl，细胞贴壁后弃去培养液，加入不同浓度的15d-PGJ2，对照组不加药，每组设6个复孔，空白对照组加入等量溶剂。分别孵育24 h、48 h、72 h及96 h，每孔加入MTT液20 μl(5 g/L)，4 h后弃去上清液，并加入DMSO 150 μl，终止反应。用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测吸光度(A值)，并以空白对照孔的A值调零。生长抑制率(E)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。重复3次。

1.5流式细胞仪检测细胞周期 取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，以2×105/ml的浓度接种于75 cm2培养瓶中于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，次日贴壁后加入终浓度分别为0.1、1、5、10、50 μmol/L的15d-PGJ2。培养48 h和72 h，收集2×106个细胞，70%冰乙醇固定，4 ℃冰箱过夜，次日检测并对样本进行细胞周期分析。

1.6AnnexinV/PI双染色检测细胞凋亡 将20 μmol/L 15d-PGJ2干预48 h的细胞制成单细胞悬液，计数取1×106个细胞置离心管内，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml PBS缓冲液，重复上述操作。再加入500 μl的上样缓冲液，轻轻震荡使细胞悬浮，依次加入10 μl AnnexinV-FITC，5 μl碘化丙啶(PI)轻轻混匀，避光室温反应15 min。随即进行流式细胞仪检测。

1.7逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测药物干48 h PPARγ mRNA的表达 利用TRIzol法提取总RNA，严格按照RT-PCR试剂盒说明操作，分别以不同引物扩增PPARγ和内参照β-actin。各引物序列如下：β-actin上游，5'-AAG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'；下游，5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT G-3'，扩增片段为176 bp；PPARγ上游，5'-CAG GAG CAG AGC AAA GA-3';下游，5'-GGA CTC AGG GTG GTT CA-3'，扩增片段为474 bp。PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35次循环；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以待测基因与相应内参照条带面积灰度值比值作为mRNA相对表达量。

1.8免疫细胞化学检测相关凋亡蛋白的表达 采用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP法)染色试剂盒，工作浓度为1∶200，按试剂盒说明进行操作。

1.9统计学方法 采用统计学软件SPSS15.0进行方差分析和t检验，组间两两比较用Student-Newan-Keuls检验。

2 结 果

2.1生长曲线描记 培养过程中，骨肉瘤MG63细胞生长较为迅速，传代后短期内处于潜伏适应期，随后便进入对数生长期，细胞数目显著增多，达到平台期后，生长稳定，细胞分裂增殖速度逐渐变慢，最后直至衰老，细胞数目明显减少。

2.2不同时间浓度的15d-PGJ2干预MG63细胞增殖的结果 同一浓度的15d-PGJ2对MG63细胞的生长抑制作用24 h与48 h比较有差异(P<0.01)，48 h、72 h及96 h时间范围内随着时间的延长其抑制率并无差异(P>0.05)。在各个时间点，任两个浓度组两两比较的均有差异(P<0.05)，相同时间点的抑制率从0.1 μmol/L至50 μmol/L随着药物浓度的递增而增加。其中在50 μmol/L浓度的抑制率几乎达到100%(表1)。15d-PGJ2药物对MG63的半数抑制率IC50为3.599 μmol/L。

表1 各浓度15d-PGJ2在不同时间对人骨肉瘤MG63细胞增殖的抑制率

2.315d-PGJ2干预人骨肉瘤MG63细胞周期的结果 ①不同浓度水平的各细胞周期分布差异有统计学意义(P=0.000)。在48 h和72 h时间点，G0/G1期、S期和G2/M期的细胞比例在5 μmol/L和20 μmol/L 15d-PGJ2两个浓度组间均有差异(P<0.05)；在两个时间点均显示为用药组G0/G1期细胞比例明显高于对照组，S和G2/M期细胞比例明显低于对照组，且随药物浓度的增加，G0/G1期比例有上升的趋势；即药物可使细胞周期G0/G1期阻滞。②不同时间点无差异(P>0.05)。见表2。

2.4AnnexinV/PI双染色检测细胞凋亡的结果 5 μmol/L 和20 μmol/L 15d-PGJ干预48 h，凋亡率分别为18.32%和32.08%，与对照组凋亡率(1.15%)比较差异显著(P<0.05)。

2.5RT-PCR检测药物干预48 h PPARγ mRNA表达的结果 对照组和20 μmol/L 15d-PGJ2浓度组电泳条带与相应的内参β-actin灰度值的比值分别为0.94±0.23和2.06±0.35，有统计学意义(P<0.05)(图1)。

1：对照组；2：15d-PGJ2处理组；M:Marker

2.6免疫细胞化学技术检测药物干预后相关凋亡基因蛋白表达的结果 20 μmol/L 15d-PGJ2干预MG-63细胞48 h，加药组caspase-3和Bax蛋白表达的阳性率(分别为126.46±3.83和135.36±6.72)明显增高于对照组(86.46±3.73和97.08±3.84)(P<0.05)；而加药组P53和bcl-2蛋白表达阳性率(分别为135.06±2.73，126.17±3.54)明显低于对照组(163.29±4.67和181.34±5.76)(P<0.05)。

表2 各浓度15d-PGJ2作用48 h和72 h时人骨肉瘤MG63的细胞周期分布

3 讨 论

PPARs是配体激活的转录因子，靶基因的转录激活依赖于配体与受体的结合〔3〕。其中15d-PGJ2是PPARγ的内源性天然配体，与该受体具有特异的亲和作用。近期研究表明，PPARγ在乳癌、前列腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞中都有表达，并且配体激活的PPARγ有抑制细胞增殖，诱发凋亡信号，诱导分化以及抗血管生成的作用〔4～6〕。本实验采用结果表明，15d-PGJ2可使MG63细胞阻滞于G1期，抑制细胞DNA的合成，使S期细胞减少，阻止细胞进入M期，经有丝分裂而产生的子代细胞数减少，这与细胞增殖实验的结果一致。本实验结果显示，一定范围浓度的15d-PGJ2可诱导MG-63细胞凋亡，且具有明显药物浓度依赖性。本研究发现，15d-PGJ2可使PPARγ mRNA表达量明显升高，同时凋亡相关基因caspase-3和Bax表达上调，由对照组不同程度的阴性或弱阳性变为阳性表达，而P53和bcl-2基因的表达下调，由对照组阳性表达转为弱阳性或阴性表达。由此推测15d-PGJ2诱导骨肉瘤细胞凋亡可能与激活其受体PPARγ，诱导bcl-2/Bax比例的变化以及促进caspase-3的表达而促进肿瘤细胞凋亡的途径有关。野生型P53可能通过上调Bax的表达诱导bcl-2/Bax比例的变化诱导细胞凋亡。综上所述PPARγ的激动剂15d-PGJ2能够通过抑制MG-63细胞的生长与增殖，通过细胞周期滞止与促凋亡进而达到抗肿瘤作用。人骨肉瘤MG-63细胞中PPARγ的高表达可能为骨肉瘤的预防与治疗提供新的治疗靶点。

4 参考文献

1Petta E，Sotiropoulou-Bonikou G，Kourelis K，etal.Differential expression and cross-talk of peroxisome proliferator-activated receptor γ and retinoid-X receptor α in urothelial carcinomas of the bladder〔J〕. BUON，2010；15(4)：740-5.

2Reka AK，Kurapati H，Narala VR，etal.Peroxisome proliferator-activated receptor-{gamma} activation inhibits tumor metastasis by antagonizing Smad3-mediated epithelial-mesenchymal transition〔J〕. Mol Cancer Ther，2010；9(12)：3221-32.

3Spies CM,Burmester GR,Buttgereit F. Analyses of similarities and differences in glucocorticoid therapy between rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis-a systematic comparison〔J〕.Clin Exp Rheumatol,2009；27：152-8.

4Venkatachalam G，Kumar AP，Yue LS，etal.Computational identification and experimental validation of PPRE motifs in NHE1 and MnSOD genes of human〔J〕. BMC Genomics，2009；10(Suppl 3)：S5.

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6Caria P，Vanni R．Cytogenetic and molecular events in adenoma and well-differentiated thyroid follicular-cell neoplasia.Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche〔J〕. Cancer Genet Cytogenet，2010；203(1)：21-9.