巴戟天糖链对骨骼肌成肌细胞向心肌样细胞分化的影响

于 爽 察雪湘 吴 瑶 冯国清

(郑州大学基础医学院药理学教研室，河南 郑州 450052)

巴戟天糖链是巴戟天醇提物水溶性部分中的主要有效成分，研究发现在经典成骨诱导组(地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠)中使用巴戟天水提取物和巴戟天醇提取物含药血清能显著促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化作用〔1〕。但巴戟天寡糖对成肌细胞增殖分化的研究，目前尚未见报道。本实验研究巴戟天糖链诱导成肌细胞分化为心肌样细胞的作用及机制。

1 材料与方法

1.1动物、药品与试剂、仪器 新生1～3 d SD大鼠(合格证号：410116)，雌雄不限，由河南省实验动物中心提供。巴戟天(购自广东省德庆县药材公司，一等品，河南省药品检验所李杰鉴定) 生药15 kg 粉碎后，分次用体积分数为0.70的乙醇在90℃水浴中煮60 min，将乙醇提取液旋蒸回收乙醇，得浓缩液。用适量的蒸馏水稀释后，分别用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，弃去乙醚、乙酸乙酯、正丁醇可溶部分，得到醇提物的水溶部分，用层析柱方法分离收集糖链部分，其纯度为98.76%。Desmin抗体由武汉博士德公司出品；PCRKit(AMV)Ver.2.1试剂盒由TaKaRa 公司出品；200 bp DNA Ladder Marker；GATA-4、β-actin引物由上海生工公司合成。HERA cell二氧化碳培养箱(德国GmbH公司)，PCR扩增仪(Sigma公司)；数码凝胶图像处理系统(UVI公司)。

1.2方法

1.2.1乳鼠后肢骨骼肌成肌细胞的培养〔2〕无菌条件下剪取SD大鼠后肢骨骼肌，剪成1～2 mm3的碎块，用含抗生素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次静置1 min并弃上层液。加入浓度为0. 05 %的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化约40 min，1 000 r/min离心10 min，弃上清，再加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，立即加入少许PBS液中止消化， 1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入PBS液轻轻吹打，100目尼龙网过滤，收集滤液。1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬。经重悬的细胞移入培养瓶中，高密度接种，置37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱。90 min后，吸出上层液，离心计数，以1×105/ml细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，放入培养箱静置培养。实验采用培养的原代成肌细胞。

1.2.2成肌细胞鉴定 用Desmin 抗体对分裂增殖4～5 d的成肌细胞进行间接免疫酶染色。

1.3实验分组 分空白对照组、5-氮杂胞苷阳性药对照组(10 μmol/ml)、巴戟天寡糖大、中、小(500、300和100 μg/ml)剂量组。

1.4观察各组成肌细胞对异丙肾上腺素(IP)的反应 取各组中具有自主跳动的成肌细胞(融合的细胞团)视野，分别观察加入IP前后(IP终浓度为0.1 μmol/ml)各组多个视野下搏动的细胞团，并计数细胞团每分钟搏动的频率(次/min)。

1.5RT-PCR法检测各组成肌细胞心脏转录因子GATA-4 mRNA的表达 Trizol提取细胞总RNA，参照TaKaRa PCR Kit(AMV)Ver.2.1试剂盒提供的条件进行逆转录，外引物序列：上游5'- AATCTCGATATGTTTGATGAC - 3' ；下游5'- GCTGCTGTGCCCATAGTGAG - 3' ;扩增片段长度528 bp。内引物序列上游：5' CCTCTCCTGTGCCAACTGCC - 3' 下游：5'- GCTGCTGCTGCTGCTGG - 3'； ;扩增片段长度272 bp。巢式PCR扩增GATA-4：第一轮引物反应条件：94℃ 2 min，扩增条件：94℃ 变性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸2 min，25个循环。72℃，5 min,最后降至4 ℃取出，-20℃保存。第二轮引物反应条件：94℃ 2min，扩增条件：94℃ 变性1 min,63℃退火1 min,72℃延伸2 min,共30个循环。延伸条件：72 ℃，5 min,最后降至4℃取出，-20℃保存。选用β-actin作内参，上游5'- AGG TGA GAG GGA AAT CGT GCG - 3'；下游 - 3'-CGTG TCA CGA CAG ACC GTG-5',扩增片段长度299 bp，反应条件：预变性：94℃ 2 min， 扩增条件：94℃ 变性30 s,51 ℃退火45 s,72℃延伸40 s。共32个循环。延伸条件：72℃，7 min,最后降至4℃取出，-20℃保存。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶行水平电泳，电泳条件：电压5 V，30 min，溴乙锭显色，用凝胶成像分析仪(UVI)观察分析电泳结果。

1.6统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1成肌细胞的鉴定 将分裂增殖4～5 d的成肌细胞用Desmin 抗体进行间接免疫酶染色,成肌细胞desmin 胞质呈阳性反应,细胞核外周及胞质呈棕黄色;表明培养的细胞为成肌细胞。见图1。

图1 成肌细胞Desmin抗体染色阳性细胞 (×400)

2.2巴戟天糖链对IP诱发的成肌细胞自主搏动反应的影响 结果表明：各组成肌细胞搏动对IP均有反应，表明IP对成肌细胞有正性变时作用。与空白对照组相比，IP对巴戟天糖链小剂量组成肌细胞正性变时作用不明显(P> 0.05)；而IP对巴戟天糖链中剂量组和巴戟天糖链大剂量组成肌细胞正性变时作用更加明显(P<0.05)。与阳性药组相比，IP对巴戟天糖链中剂量组和巴戟天糖链大剂量组成肌细胞正性变时作用更明显(P<0.05)，提示巴戟天糖链具有诱导成肌细胞向心肌样细胞分化的潜在可能。见表1。

表1 巴戟天糖链对IP诱发的成肌细胞自主搏动反应的影响

1：GATA-4(巴戟天糖链500 μg/ml)；2：β-actin(巴戟天糖链500 μg/ml)；3：GATA-4(巴戟天糖链300 μg/ml)；4：β-actin(巴戟天糖链 300 μg/ml)；5：GATA-4(巴戟天糖链 100 μg/ml)； 6：β-actin(巴戟天糖链 100 μg/ml)；7：GATA-4(空白对照)； 8：β-actin(空白对照)；9：GATA-4(5-氮杂胞苷10 μmol/ml)；10：β-actin(5-氮杂胞苷10 μmol/ml)；11： Marker

2.3巴戟天糖链对大鼠成肌细胞GATA-4 mRNA表达的影响 巢式PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，可分别于272 bp (GATA-4) 、299 bp(β-actin)见到条带(图2)，与设计引物相符。半定量RT-PCR结果提示: 空白对照组成肌细胞，未见GATA-4 mRNA的表达；而阳性药对照组及巴戟天糖链的小、中、大剂量组均出现了GATA-4 mRNA的表达(0.51±0.04、0.67±0.11、0.84±0.06、1.02±0.08)；与阳性药对照组相比，巴戟天糖链小、中、大三个各剂量组均可明显上调GATA-4 mRNA的表达(P<0.05)，并随剂量增加表达增强。

3 讨 论

心肌梗死后存活心肌细胞数量下降而导致最终的心功能不全已成为心肌梗死患者预后死亡的主要原因。细胞移植技术，为心肌坏死区的细胞重建及衰竭心脏的功能恢复，提供了一种全新的治疗策略〔3〕。骨骼肌成肌细胞是首先被应用于临床试验、并在临床试验中研究最多的移植细胞〔4〕。

本实验结果提示：巴戟天糖链具有诱导成肌细胞向心肌样细胞分化的潜在可能。原因在于巴戟天寡糖刺激了成肌细胞膜上“β受体”的表达，从而增强了成肌细胞对IP的反应。如进行心肌内移植时，巴戟天糖链诱导后的成肌细胞可望改善心肌的收缩性，加强心脏的收缩力。但如何解决成肌细胞自主收缩频率与心肌细胞的差异，有待进一步研究。

GATA家族是含有锌指结构的一组转录因子，具有结合核酸共同序列(A/T)GATA(A/G)的特性。其中GATA-4是目前研究较多的与心脏发育密切相关的转录因子，参与了心脏正常发育、功能基因表达的过程。GATA-4是某些心肌特异性基因的高效转录激活因子，也是心肌特异性基因时序性表达过程中一个关键的调控因子〔5〕。在胚胎发育中，可以在心肌祖细胞中检测到GATA-4的表达。

巴戟天寡糖可诱导成肌细胞出现心脏转录因子GATA-4 mRNA的表达，并成一定的剂量相关性。巴戟天寡糖诱导成肌细胞分化过程中，可能发挥了某些心血管方面的药理活性，使得诱导分化后的细胞可表达GATA-4 mRNA，其机制可能是通过细胞外信号调节激酶使GATA-4磷酸化，或者是通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3-kinase)激活通路来激活GATA-4，使GATA-4转录活性增高〔6〕。巴戟天寡糖诱导成肌细胞是否有GATA-4蛋白的表达，是否有心脏其他特有的转录因子的表达，有待进一步深入研究。

4 参考文献

1王和鸣，王 力，李 楠. 巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化影响的实验研究〔J〕. 福建中医学院报，2004；14(3)：16-20.

2黄桂林，李龙江，谢文杨. 新生SD大鼠成肌细胞体外培养的实验研究〔J〕.实用口腔医学杂志，2003；19(1):16-8.

3Hagege AA,Carrion C,Menasche P,etal. Viability and differentiation of autologous skeletal myoblast grafts in ischaemiccardiomyopathy〔J〕.Lancet,2003;361(9356):491-2.

4Pagani FD,DerSimonian H,Zawadzka A,etal. Autologous skeletal myoblasts transplanted to ischemia-damaged myocardium in humans histological analysis of cell survival and differentiation〔J〕. J Am Coll Cardiol,2003;41(5):879-88.

5Grepin C,Nemer G,Nemer M. Enhanced cardiogenesis in embryonic stem cells overexpressing the GATA-4 transcription factor 〔J〕. Development,2003;124(21):2387-95.

6Alisi A,Spaziani A,Anticoli S,etal. PKR is a novel functional direct player that coordinates skeletal muscle differentiation via p38 MAPK/AKT pathways〔J〕. Cell Signal,2008;20(3):534-42.