雌二醇对成骨细胞OPG和RANKL的影响

龚 沂

(南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006)

骨质疏松是目前老年常见的骨代谢性疾病，随着社会老龄化其发病越来越多且以绝经后妇女为主。大量的基础研究已肯定了雌激素的保护作用，但其作用机制仍不明〔1〕。近年来随着护骨素(OPG)的发现，对OPG/细胞核因子-κB受体活化因子(RANK)/细胞核因子-КB受体活化因子配体(RANKL)系统的研究受到关注，这些细胞因子在调节破骨细胞的形成和活化方面起着关键的作用，是诸多骨代谢调节激素或因子在细胞水平发挥作用的共同通道〔2，3〕。本实验通过观察17β雌二醇(17β-E2)对成骨细胞(OB)分泌的OPG、RANKL表达的影响，旨在探讨雌激素治疗骨质疏松的机制。

1 材料和方法

1.1材料 MEM培养基干粉购自GIBCO BRL公司；小牛血清、胎牛血清购自NBS GIBCO BRL公司；17β-E2、Ⅱ型胶原酶、核酸分子量标准购自Sigma公司；大鼠白血病病毒(MMLV)第一链cDNA合成试剂盒、即用PCR扩增试剂盒购自上海生物工程技术公司；OPG、RANKL引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养 酶消化法分离培养24 h内新生SD大鼠(来自南昌大学医学院动物实验科学部)颅盖骨OB，通过碱性磷酸酶染色、矿化结节染色对成骨细胞进行鉴定。

1.2.2干预试验 传代时将细胞接种于25 cm2培养瓶，汇合后加入即配的药物干预，分为对照组、10-10mol/L组、10-9mol/L组、10-8mol/L组、10-7mol/L 17β-E2组。细胞生长汇合后，抽提总RNA。

1.2.3RT-PCR检测 Trizol抽提总RNA，MMLV第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，PCR扩增OPG、RANKL基因，GAPDH为内对照。OPG正义：5′-TGC TTT CGA TGA CGT CTC AC-3′，反义5′-CAC TGC ACA GTC AGG AGG AA-3′，扩增长度为318 bp；RANKL正义：5′-GCG CTC GAA AGT ACA GGA AC-3′，反义：5′-AGC CGA GAC TAC GGC AAG TA-3′，扩增长度为208 bp。OPG反应条件: 94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环，最后延伸5 min。RANKL反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环，最后延伸5 min。PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统进行条带光密度定量检测。

2 结 果

2.1OB鉴定 原代OB培养3 d后呈多角形、梭形，12～15 d呈细胞单层贴壁，传代细胞胞核较大，细胞质内见黑色颗粒，细胞形态为多角形或梭形，见突起，见图1；三代细胞碱性磷酸酶染色阳性，胞质见大量灰黑色颗粒，细胞鉴定符合成骨细胞特征，见图2。

图1 成骨细胞呈梭形或三角形

图2 成骨细胞碱性磷酸酶染色(×100)

2.2不同浓度17β-E2对OB OPG和RANKL mRNA的影响 见表1，图3。本实验中RT-PCR半定量结果显示，与对照组相比，不同浓度(10-9、10-8、10-7mol/L)的17β-E2对OB OPG mRNA表达具有显著的增强作用(P<0.05)，其中10-8mol/L 17β-E2对OB OPG mRNA表达最高，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，而10-10mol/L 17β-E2对OB OPG mRNA表达几乎无影响，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，10-10、10-9、10-7mol/L 17β-E2对OB细胞RANKL mRNA表达几乎无影响，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，其中10-8mol/L 17β-E2对OB RANKL mRNA的表达具有明显的抑制作用，其RANKL mRNA表达与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同浓度17β-E2对OB OPG、RANKL mRNA表达的影响

1：核酸分子量标志物；2：对照组；3：10-10 mol/L 17β-E2组；4：10-9 mol/L 17β-E2组；5：10-8 mol/L 17β-E2组；6：10-7 mol/L 17β-E2组

3 讨 论

OPG于1997年首次发现，近年来受到较多关注。OPG通过与RANKL结合，而阻断其与RANK受体结合。当RANKL与OPG结合时，抑制破骨细胞前体分化和成熟破骨细胞形成骨陷窝，并诱导破骨细胞凋亡〔4〕。研究显示，OPG+/+鼠表现为大理石样骨硬化病，其硬化程度与OPG mRNA水平呈正相关。OPG-/-鼠则表现出严重骨质疏松和动脉钙化。RANKL一旦与RANK结合，可激活细胞核因子-κB和c-Jun氨基端激酶，刺激前体破骨细胞分化、增殖与融合，活化成熟破骨细胞，抑制其凋亡〔5，6〕。当它与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)同时存在时，不需要OB、骨髓基质细胞和其他任何因子可剂量依赖式地增加破骨细胞的形成和融合〔7〕，促进破骨细胞骨吸收。有研究证实，雌激素可通过增加去卵巢鼠股骨中的OPG和RANKL的表达，抑制破骨性骨吸收，对去卵巢鼠的骨质疏松有明显的治疗作用〔8〕。

本研究结果提示了不同浓度17β-E2促OB OPG表达。另一方面，17β-E2抑制OB RANKL表达，与文献报道结果相一致〔9〕。因此，雌激素可促进OPG的表达，抑制RANKL表达，从而使OPG/RANKL比例上调，发挥雌激素的骨保护作用。

4 参考文献

1陈 娟，谢丽华，李生强，等.绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因 CLCF1 mRNA 的表达研究〔J〕.中国骨质疏松杂志，2014;20(6)： 618-22.

2王 怡，刘 伟，赵鸿雁，等.镉对大鼠成骨细胞OPG/RANKL表达的影响〔J〕.扬州大学学报：农业与生命科学版,2014;35(1)： 9-12.

3张永芝，扈英伟，徐 欣.1α，25(OH)2D3对不同分化阶段成骨细胞RANKL及OPG基因表达的影响〔J〕.中国骨质疏松杂志，2014;20(4)：382-6，403.

4陈 杰，李甘地.病理学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2005:438-9.

5Ho TY，Santora K，Chen JC，etal.Effects of relaxin and estrogens on bone remodeling markers，receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG)，in rat adjuvant-induced arthritis〔J〕.Bone，2011;48(6):136-53.

6Wang QP，Yang L，Li XP，etal.Effects of 17β-estradiol on adiponectin regulation of the expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-κB ligand〔J〕.Bone，2012;51(3):515-23.

7熊 茜，张秀珍.17β-雌二醇对新生大鼠成骨细胞护骨素和破骨细胞分化因子表达的调节〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2007;23(3):224-5.

8Su SJ，Yeh YT，Shyu HW.The preventive effect of biochanin a on bone loss in ovariectomized rats: involvement in regulation of growth and activity of osteoblasts and osteoclasts〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2013;2013:594857.

9乔 珍，綦才辉，杨关子，等.促黑素对小鼠成骨细胞 OPG /RANKL mRNA 表达的影响〔J〕.山东大学学报：医学版，2014;52(3)：56-8，63.