老年患者胃癌组织中CD44和ABCG2的表达及相关性

周 雨 易德保 蒋传命 王 乐 凌 晖

(邵阳医学高等专科学校，湖南 邵阳 422000)

胃癌是我国发病率最高的恶性肿瘤〔1～3〕。干细胞标志物(CD44)及ATP-结合盒亚家族成员2(ABCG2)是常用的研究肿瘤干细胞耐药性的分子标志物，在胃癌组织中的表达与胃癌发生及分化有明显关系。本研究观察40例老年胃癌患者的胃癌组织中CD44和ABCG2蛋白的表达情况，并就两者的相关性进行分析，从而了解CD44和ABCG2与胃癌发生及发展的联系，最终为老年胃癌的早期诊断、治疗效果评价、判断预后的肿瘤标记物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 老年胃腺癌组织40例来源于邵阳市中心医院及邵阳医专附属医院2008年1月至2009年12月的手术切除标本。其中男28例，女12例，年龄56～78〔平均(64±7.3)〕岁，术前均未接受化疗、放疗等治疗。

1.2试剂来源及试验方法 研究所用试剂包括兔抗CD44抗体、兔抗ABCG2抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色剂、免疫组化(SP)试剂盒等，所有试剂均购自Abcam公司及博士德公司。经脱蜡水化及抗原修复后将切片置于3％H2O2中淹没浸泡30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min 3次，使用10％正常山羊血清，中和非特异性反应，湿盒内放置20 min。滴加1∶1 000比例稀释的CD44抗体及1∶200比例稀释的ABCG2抗体于切片上，置湿盒内，4℃冰箱过夜。取出，室温下放置5 min，PBS洗3 min 3次，吸去水分，滴加二抗工作液，于湿盒内37℃孵育25 min。温度设置为37℃条件下，使用辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液，于湿盒内孵育20 min，此切片后经DAB底物显色、苏木素复染以及1％盐酸酒精分化处理后，将切片置于显微镜下观察及照相。计算阳性细胞及阴性细胞比率，分为 “-、+、、”4个等级，分别表示为阳性细胞比率≤10％、 11％～40％、41％～70％、>70％。

1.3细胞培养 胃癌细胞株低分化黏液腺癌(MGC803)和中分化腺癌(SGC7901)为本室保存、低分化癌(AGS)购自上海市中科院细胞库。细胞用含体积分数为10％小牛血清的RPMI-1640培养液培养于37℃、含体积分数为5％CO2恒温培养箱中培养。细胞单层生长，铺满培养瓶约80％～90％时传代。传代时常规吸去培养液，用含0.25％胰酶细胞消化液消化，在倒置显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，立即倾去胰酶细胞消化液，加适量含血清培养液吹打成单细胞悬液，按所需浓度接种。

1.4Western印迹 二喹啉甲酸(BCA)法测定细胞蛋白质含量。CD44、ABCG2表达检测：细胞裂解，收集蛋白，变性后经10％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5％牛血清白蛋白的Tris盐酸缓冲液(TBST)(Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L 含0.1％ Tween-20)封闭1 h，用CD44、ABCG2一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，5 min/次，相应的二抗孵育1 h，TBST洗3次，5 min/次，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

1.5统计学方法 应用SPSS19.0软件进行分析，组间均数比较采用t检验，组间率的比较用χ2检验。

2 结 果

2.1CD44及ABCG2的表达 CD44阳性表达呈棕黄色，主要位于细胞膜，ABCG2主要定位于细胞质，阳性表达呈明显的棕黄色颗粒。CD44蛋白在癌旁胃黏膜中的阳性率为0，在慢性胃炎组织中的阳性表达率为18.75％(3/16)，在胃癌组织中阳性表达率60％(24/40)。胃癌组织中的阳性表达率显著高于慢性胃炎组织及癌旁组织(P<0.05)；ABCG2在慢性胃炎及癌旁正常组织中的阳性表达率分别为25％(4/16)和4.54％(1/22)，而在胃癌组织中的阳性表达率可达75％(30/40)显著高于慢性胃炎组织及癌旁组织(P<0.05)。而癌旁胃黏膜ABCG2的阳性表达率与慢性胃炎组织也存在显著性差异(P<0.05)。ABCG2蛋白在不同分化程度癌细胞中的表达率均有明显差异，ABCG2蛋白在不同分化程度腺癌中的表达率顺序为低分化>中分化>高分化，表达率分别为89.47％(17/19)、63.64％(7/11)、40％(4/10)，各组比较差异有显著性意义(P<0.05)。见图1，表1。

图1 胃癌组织中CD44及ABCG2蛋白的表达(SP，×40)

表1胃腺癌、慢性胃炎和正常胃黏膜组织中ABCG2、CD44的表达(n)

与癌旁胃黏膜组比较：1)P<0.05；与慢性胃炎组比较：2)P<0.05

2.2CD44和ABCG2的相关性 ABCG2蛋白阳性表达的30例胃癌标本中有20例(66.7％)CD44阳性表达；高于ABCG2阴性标本中CD44阳性表达率〔2例(20％)〕。CD44与ABCG2蛋白之间呈正相关(r=0.94，P<0.05)。

2.3Western印迹结果 CD44和ABCG2蛋白在AGS、SGC7901、MGC803细胞中均有明显表达，其中CD44蛋白在三株细胞中的光密度值分别为(0.81±0.05)、(0.82±0.04)、(0.84±0.06)，ABCG2蛋白在三株细胞中的光密度值分别是(0.75±0.04)、(0.76±0.03)、(0.78±0.06)；组间比较，三株细胞中的表达均无明显差异(P>0.05)。见图2。

1:AGS细胞；2：SGC 7901细胞；3：MGC803细胞

3 讨 论

胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，我国胃癌死亡率呈上升趋势，多发人群年龄段为50～80岁〔4，5〕。胃癌生物学行为的相关研究是近年研究的热点及亟待突破点。CD44及 ABCG2可能成为胃癌诊断和治疗的标志物。

CD44蛋白为细胞表面的组成成分，在许多肿瘤细胞表面都可表达，如肺癌、口腔癌、肝癌、大肠癌、宫颈癌等，其作用机理是通过直接或替代途径增强了多种肿瘤细胞的转移，是参与肿瘤发生和发展的重要物质〔6，7〕。大量研究表明，CD44 可用于识别胃癌干细胞，CD44表达与胃癌的发生有明显相关性。CD44可作为胃癌干细胞的标志物应用于对胃癌干细胞的识别，并且越来越多的研究指向CD44在肿瘤的浸润与发展过程中也发挥着重要作用。本研究说明CD44参与胃癌变过程。本研究中发现，CD44不仅与胃癌发生过程有关联，CD44蛋白的高表达也与肿瘤的分化、淋巴结转移密切相关。

ABCG2 在具备肿瘤干细胞特性的侧群(SP)细胞中高表达，被认为是分离 SP 表型细胞的重要标志物〔8〕。SP 细胞的重要作用体现在肿瘤发生、发展及药物耐受等方面。ABCG2转运蛋白作为肿瘤干细胞表面标记目前受到广泛关注。Wang等〔9，10〕在宫颈癌、胰腺癌、肝癌等细胞株中均成功分离出ABCG2为阳性的细胞，其具有典型的干细胞特征。对ABCG2在胃癌中的表达研究，有助于发现胃癌干细胞的表面标记，从而显著优化胃癌的治疗效果，同时能对研究胃癌的发生机制有着积极的促进作用及重要意义。本研究结果说明ABCG2参与胃癌的发生过程。ABCG2蛋白表达随着分化程度逐渐降低呈现升高趋势。目前研究发现，大部分胃癌组织都为单独表达CD44或ABCG2，但也有研究发现癌组织同时有CD44及ABCG2的升高。

综上所述，CD44是胃癌干细胞的标志物，在胃癌变过程中有表达升高现象，CD44可能参与胃癌的发生。其白作为SP 细胞特异性表面标志物，ABCG2的表达与胃癌等恶性肿瘤的发生有密切关系。在胃癌的发生、进展中ABCG2和CD44可能起到一定的协同作用，针对两者关系进行全面检测具有重要意义，一方面对于胃癌早期诊断，ABCG2和CD44是重要的检测指标；另一方面对于胃癌治疗效果，ABCG2和CD44的表达可以作为重要的评判依据。

4 参考文献

1Saka M，Morita S，Fukagawa T，etal.Present and future status of gastric cancer surgery〔J〕.Jap J Clin Oncol，2011；41(3)：307-13.

2Yasui W，Sentani K，Sakamoto N，etal.Molecular pathology of gastric cancer：research and practice〔J〕.Pathol Res Pract，2011；207(10)：608-12.

3摆 斌.胃癌中MTA2，MMP-7和MMP-14的表达关系〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(13)：3085-7.

4雷大钊，黄炯强，雷 建，等.老年胃癌的临床病理特征〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(1)：82-4.

5钟武装，肖丽萍，蔡敏捷.早期肠内营养对老年胃癌患者术后免疫功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(2)：280-2.

6Zhang C，Li C，He F，etal.Identification of CD44+，CD24+gastric cancer stem cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2011；137(11)：1679-86.

7Henry JC，Park JK，Jiang J，etal.miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2010；403(1)：120-5.

8Ni Z，Bikadi Z，Rosenberg MF，etal.Structure and function of the human breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2)〔J〕.Curr Drug Metab，2010；11(7)：603-17.

9Wang YH，Li F，Luo B.A side population o f cells from a human pancreatic carcinom a cell line harbors cancer stem cell characteristics〔J〕.Neoplasma，2009；56(5)：371-8.

10刘 晨，安晓霞，张 凡，等.肿瘤干细胞相关基因ABCB1、ABCG2表达与宫颈上皮恶变及发展关系的研究〔J〕.现代妇产科进展，2012；21(4)：294-7.