复智散对阿尔茨海默病转基因鼠脑神经细胞内神经颗粒素通路的影响

宋冬晶 刘 斌 刘新宇 王 晔 王德生 纪 勇

(哈尔滨市第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

神经颗粒素(Ng)是特异性神经元突触后膜蛋白，是神经可塑性及学习记忆调控过程中的一个重要蛋白，其基因表达和蛋白质合成主要分布于海马、前额皮层、纹状体和杏仁核〔1〕。作为突触后蛋白激酶(PK)C的作用底物和Ca2+敏感性钙调蛋白(CaM)结合蛋白，Ng主要通过调控Ca2+和CaM依赖性酶包括Ca2+- CaM依赖性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ等，参与学习记忆过程〔2～6〕。本文通过观察复智散对转基因阿尔茨海默病(AD)小鼠脑神经细胞内Ng通路的影响，探讨复智散治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物及分组 6月龄APP/PS1 双重转基因小鼠，购自南京大学模式动物研究所。正常对照组为15只相同遗传背景同月龄的C57BL/6J小鼠。实验随机分为对照组(蒸馏水23 ml/d)、模型组(蒸馏水23 ml/d)、低剂量组(1.25 g/kg)、中剂量组(2.5 g/kg)、高剂量组(5.0 g/kg)、安理申组(0.54 mg·kg-1·d-1)，各组15只。连续灌胃21 d。

1.2药物 复智散(FZS)，哈医大一院王德生教授研发，由人参、节菖、蒲黄芩等八味中草药组方而成。水浸泡40 min，煎煮1 h，过滤出药汁。加水煎煮40 min后再次过滤，将两次滤过的药汁混合，配制成FZS浓度为0.25 g生药/ml的提取液，于4℃保存。安理申(盐酸多奈哌齐)，5 mg/片，购自卫材药业。

1.3Western印迹检测蛋白表达量 脑组织剪至约150 mg，加300 μl蛋白质抽提液，匀浆。最高速度漩涡振荡5 s。12 000 r/min，4℃离心5 min。迅速把上清液转移至另外一个预冷的离心管，-20℃保存。加样到96孔板，标准品稀释液调整最终量到20 μl；A570 nm波长下检测OD配平各组蛋白；1∶4的比例加入SDS-PAGE5倍上样缓冲液，水煮，直至蛋白质变性电泳分析。曝光显影。

2 结 果

2.1行为学实验结果 模型组潜伏期明显长于对照组(P<0.01)；各用药组潜伏期均有不同程度改善，中剂量组和安理申组的潜伏期明显短于模型组(P<0.01)，中剂量组与安理申组比较无显著性差异(P>0.05)。模型组小鼠电击时间明显长于对照组(P<0.01)；各用药组的电击时间均短于模型组，其中中剂量组、安理申组最明显(P<0.01)，而中剂量组与安理申组电击时间比较无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠行为学实验结果比较

2.2小鼠海马Ng信号通路表达水平变化 模型组鼠Ng蛋白表达量较对照组显著降低(P<0.01)。与模型组比较，安理申组、高剂量组、中剂量组、低剂量组Ng 蛋白均有不同程度增高，其中安理申组、中剂量组变化最明显，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)，中剂量组优于安理申组。

对照组Aβ、APP、BACE 和PS-1蛋白表达量较低；模型组转基因小鼠脑细胞内APP蛋白表达量较对照组APP蛋白表达量明显增多，其中Aβ、BACE 和PS-1蛋白表达增加更显著(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，安理申组、高剂量组、中剂量组、低剂量组APP的蛋白表达量均有不同程度降低，其中安理申组、中剂量组变化最明显(P<0.05或P<0.01)。APP、BACE和PS-1蛋白表达量安理申组与中剂量组无显著差异。复智散中剂量组Aβ蛋白表达明显低于安理申组(P<0.05)。

3 讨 论

生理状态下，Ng与CaM结合形成复合体，当神经冲动引起NMDAR活化，与受体偶联的Ca2+通道开放，细胞内Ca2+浓度升高，Ng与CaM复合体解离，游离Ng被PKC磷酸化，与CaM亲和力降低，细胞内Ca2+与CaM复合体浓度增加，激活Ca2+和CaM依赖性酶，如CaM依赖性NO合酶、CaMKⅡ及CaM依赖性腺苷酸环化酶AC1、AC8等，这些酶均参与LTP的诱导和维持，因此Ng是调控学习和记忆过程的重要蛋白。进一步研究发现，Ng基因敲除的小鼠海马LTP明显受损，空间学习能力受损，提示了Ng在学习记忆过程中的重要作用〔7～9〕。

实验证实，Ng主要是通过促进依赖于Ca2+的信号转导途径提高海马LTP和学习记忆能力〔10〕，即神经元内Ng浓度越高，Ng-CaM复合体的形成越多，Ng可被视为神经元内CaM的储库。因而当Ca2+流入细胞内，将有更多的CaM与Ca2+结合，有利于激活Ca2+与Ca2+-CaM依赖的信号级联反应，包括PKC、CaMKⅡ。最近，有研究进一步证实Ng作为记忆形成机制的上游调控子，通过调控游离的Ca2+和CaM，在PKC介导的信号转导途径中起关键作用。

模型组鼠海马NMDAR的关键亚基NR1表达水平降低，这可能是认知功能下降的原因之一。AD鼠海马和前额皮层Ng蛋白表达水平下降。同时，Ng信号转导途径中的两个关键酶PKC和CaMK水平也明显下降。提示AD可能通过影响中枢重要脑区中以Ng为上游调控子的信号转导通路损害机体的学习记忆功能；FZS可通过提高Ng通路蛋白表达而改善AD鼠的认知功能。

4 参考文献

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