单次负荷剂量瑞舒伐他汀预处理对再灌注损伤挽救激酶信号通路的影响和心肌保护

王 凌 林 荣 潘国焰 吴 兵

(福建医科大学附属泉州市第一医院心内科，福建 泉州 362000)

研究证实他汀类药物较长时间持续应用能减少缺血再灌注损伤，但关于他汀短期用药尤其是单次负荷剂量疗效的基础研究甚少，经皮冠状动脉介入(PCI)术前给予负荷剂量的某些他汀类药物治疗可以减轻心肌损伤〔1〕，其机制推测部分可能与减轻缺血再灌注损伤有关；而有关单次负荷剂量瑞舒伐他汀缺血前预处理对再灌注损伤影响的基础研究目前罕见报道。本实验通过再灌注前给予单次负荷剂量瑞舒伐他汀观察其能否减轻在体家兔心肌缺血再灌注损伤，并探讨其对再灌注损伤挽救激酶(RISK)信号通路的影响及潜在的心肌保护机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用84只健康成年雄性大耳白兔(由福建医科大学实验动物中心提供)，体重2.5～3.0 kg，兔龄120～140 d。

1.2主要制剂 瑞舒伐他汀钙原粉(浙江昌明药业有限公司)；TTC染色剂、伊文思蓝、LY294002、PD98059(均购自美国Sigma公司)，P-蛋白激酶B(Akt)、Akt、P-细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)1/2、ERK1/2抗体(均购自美国Santa Cruz公司)。

1.3制备兔缺血/再灌注模型 借鉴文献〔2〕，将家兔麻醉后固定，连接LEAD2000多导生理仪记录进行心电监护并记录肢体导联心电图。经胸骨左缘2～4肋开胸并剪开心包，寻找冠状动脉左室支(多沿左心耳下行至心尖处)并于其近段附近以6～0细针线穿过左室支下方，进针深度约0.3 mm，线两侧穿入同一根橡皮小管以形成闭环，拉紧闭环即造成冠脉闭塞，导致局部心肌缺血，直视下可观察到左室支供血区域的心肌颜色由红色变为暗灰色，左室下、后壁心肌搏动明显减弱，同时心电图出现明显的ST段弓背向上型抬高(Ⅱ、Ⅲ、avF导联)，回撤松开闭环即可使局部心肌恢复再灌注。

1.4实验分组 随机均分成7组，每组12只。假手术组仅开胸而不进一步处理，术前12 h静脉注射生理盐水1 ml/只；对照组(缺血再灌注组)术前12 h静脉注射生理盐水1 ml/只；RS组术前12 h静脉注射RS 5 mg/kg(用生理盐水溶解，溶成1 ml)；RS+LY294002组术前12 h静脉注射RS 5 mg/kg，再灌注前5 min注射LY294002(0.3 mg/kg)；LY294002组再灌注前5 min静脉注射LY294002(0.3 mg/kg)；RS+PD98059组术前12 h静脉注射RS 5 mg/kg，再灌注前5 min注射PD98059(0.3 mg/kg)；PD98059组再灌注前5 min静脉注射PD98059(0.3 mg/kg)。7组体重、兔龄无显著性差异(P>0.05)。

1.5观察指标 ①心电图。常规描记缺血前、缺血5、20、40 min和再灌注10、30、60、120、180 min时肢体导联心电图，观察并记录实验全程发生的各种心律失常情况。②心肌缺血范围=梗死范围测定。实验结束原位结扎左室支，抽取2％伊文思蓝2～3 ml注入左心室，非缺血心肌被染成蓝色，缺血区心肌因无灌注而不被染色(无蓝染)。注射10％氯化钾使心脏停搏并立即摘取心脏，仔细分离左心室染色区和非染色区，称重后将非染色区(缺血区)置-20℃冰冻保存5 min后，沿左心室长轴横切为5～6片厚约2 mm的心肌片，先置于1％TTC磷酸缓冲液中，后置于37℃恒温进行水浴，缺血区因TTC被脱氢酶还原而呈现深红色，梗死区因TTC无法被还原而呈灰白色，染色结束后用蒸馏水冲洗，随后置于4％多聚甲醛中固定12 h，根据局部颜色差异进一步将梗死区和非梗死区分离，吸干后分别称重。心肌缺血范围以缺血区心肌重量/左室重量×100％，心肌梗死范围=坏死区心肌重量/缺血区心肌重量×100％来表示。

1.6Western印迹法检测Akt、P-Akt、ERK1/2及P-ERK1/2蛋白的表达 分离左心室缺血区心肌，用预冷PBS液洗涤后称取100 mg心肌组织，在液氮中研磨成粉末，加入1 ml单去污剂裂解液，充分裂解细胞后，置12 000 r/min离心15 min，分离收集上清液，-20℃保存备用。用BCA蛋白定量试剂盒进行心肌组织蛋白定量。各取50 μg待测蛋白样品进行SDS-PAGE，电转移至NC膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应的Akt、P-Akt、ERK1/2、P-ERK1/2抗体(均为1∶1 000)4℃孵育过夜，PBST洗涤后加入稀释1：2 500的二抗室温孵育1 h，洗涤沥干后加入ECL Plus试剂进行ECL显影。最后用Leica图像分析软件测定图片上每个特异性条带灰度值。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1各组心肌缺血范围及梗死范围比较 与对照组比较，各组缺血心肌范围均无统计学差异(P>0.05)；RS组心肌梗死范围明显降低(P<0.05)，其余各组无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组心肌缺血范围及梗死范围比较

2.2各组Akt、P-Akt、ERK1/2及P-ERK1/2蛋白的表达 与假手术组比较，对照组P-Akt、P-ERK1/2水平明显增加(P<0.05)；RS组P-Akt、P-ERK1/2水平比对照组明显增加(P<0.05)；RS+LY294002、LY294002组P-Akt及RS+PD98059、PD98059组P-ERK1/2的水平较RS组均明显降低(P<0.05)。见图1和表2。

a.假手术组；b.对照组；c.RS组；d.RS+LY294002组；e.LY294002组；f.RS+PD98059组；g.PD98059组

与假手术组比较：1)P<0.05；与对照组比较：2)P<0.05；与RS组比较：3)P<0.05

3 讨 论

瑞舒伐他汀是近年来新发现的一类亲水性他汀，相较其他他汀类，其水溶性和降低低密度脂蛋白(LDL)的效果更强。Ke等〔7〕发现RS能通过诱导CD4、CD25调节性T细胞而发挥对缺血再灌注损伤保护作用，Wu等〔8〕等近期发现单次负荷剂量RS能通过抑制氧化应激和高迁移率族蛋白(HMGB)1，减少兔心梗面积。Jiang等〔9〕等发现急性冠脉综合征患者PCI术前单次负荷剂量的RS(40 mg/d)能有效抑制PCI术后再灌注心肌损伤，其机制与抑制氧化应激有关。

RISK信号通路是指一组促存活蛋白激酶，主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)，Akt和Erkl/2。PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导通路，激活后可进入细胞质和细胞核，诱导内皮型氧化亚氮合酶(eNOS)及调节p70s6K、糖原合成激酶-3B，抗凋亡因子Bcl-2的表达，进而抑制线粒体可渗透转运孔隙(mPTP)的开放，或通过影响蛋白质转译而发挥作用。后者系丝裂素活化蛋白激酶家族中成员之一，激活后可通过磷酸化一系列转录因子，或触发了细胞内抗凋亡信号机制而产生心肌保护作用〔10，11〕。目前的研究发现，该信号系统的激活正是缺血预适应和缺血后适应所介导的心肌保护的重要机制〔12～14〕；Hausenloy等〔10〕对大鼠心肌进行缺血预处理研究时发现再灌注前多次心肌缺血可诱导Akt和ERK1/2的磷酸化水平升高，并缩小心肌梗死面积，应用相应的抑制剂抑制PI3K/Akt和ERK1/2磷酸化则无法缩小心梗面积。Fujita等〔14〕等对大鼠进行缺血后适应研究也发现后者可激活ERK1/2磷酸化，应用ERK1/2的抑制剂可以取消后适应所带来的心肌保护作用。

本研究表明再灌注能诱导RISK信号通路活化；提示RS单次负荷剂量的确可产生再灌注心肌保护，其机制可能与RISK进一步激活有关，RS所产生的有益影响可被PI3K抑制剂或ERK1/2抑制剂抵消，证实了PI3K/Akt和ERK1/2通路激活在RS组心肌保护中起重要作用。提示单独使用PI3K抑制剂和ERK1/2抑制剂或即使合用RS均不能产生足够的心肌保护。综上，单次负荷剂量RS预处理可能通过激活RISK信号通路对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。但RISK信号通路中Akt与ERK1/2之间的关系及其深层机制仍待研究明确。

4 参考文献

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