缺氧对肺动脉血管内皮细胞线粒体膜电位的影响及Ghrelin的保护作用

孙相华 洪文娟 洪志鹏 周 菊 祝艳翠 王亚丽

(昆明医科大学第一附属医院干部医疗科，云南 昆明 650032)

缺氧是引起机体损伤的最常见因素之一，缺氧可以导致肺血管内皮出现明显损伤，肺血管内皮细胞附于血管腔内壁，它可以分泌多种血管活性物质，如果血管内皮损伤或功能异常，会发生心脑血管疾病。此外，缺氧还会导致肺部血管内皮细胞合成和释放内皮素(ET)-1升高，并且激活钙通道或磷脂酰肌醇系统，引起细胞内出现过量的钙，从而使细胞受到损害〔1〕。线粒体是细胞进行能量代谢的场所，同时线粒体也参与细胞凋亡，线粒体受到破坏会导致细胞死亡。线粒体膜电位(MMP)是用来评价线粒体功能的指标之一〔2〕。Ghrelin是从大鼠胃黏膜提取出的，是生长激素促分泌素受体(GHSR)的内源性配体〔3〕。本研究采用细胞缺氧模型研究缺氧对人肺动脉血管内皮细胞MMP的影响及Ghrelin的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 二甲基亚砜(BIO RAD公司)，Ghrelin(Phoenix Pharmaceutical公司)，胰蛋白酶(华美生物工程公司)，人肺动脉内皮细胞(C-008-5C)(美国Cascade Biologies)，Medium200培养基(M-200-500)(Cascade Biologies公司)，一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，细胞培养箱(Asheville1NC公司)，ET放免试剂盒(亚法生物公司)，激光共聚焦显微镜(MRC21024，美国BIO RAD公司)，缺氧通气环(自制)。

1.2制作缺氧通气环 将内径1.2 mm的金属铜管按照培养皿内径大小作成环状管，使其紧贴在培养皿内壁。然后在环形管上制出分布均匀的多个微小细孔，用来通气。封闭环状管的一端，用直径相等塑料导管连接另一端，然后通过这个塑料导管连接到氮氧混合气罐上。

1.3人肺动脉内皮细胞的培养与传代接种 冻存的人肺动脉内皮细胞采用常规的方法复苏，用培养液将细胞调整到适合浓度后接种到无菌细胞培养瓶中，在细胞培养箱中培养并传代。细胞传到第3代的时候，按1×105/mm的密度接种到培养皿后继续培养，当细胞长满培养皿后，进行下一步实验。

1.4实验分组 将人肺动脉内皮细胞分为3组：①对照组：只加入细胞培养液；②单纯缺氧组：加入细胞培养液，并进行缺氧因素干预；③缺氧+Ghrelin组：加入含有1.0×10-7mol/L Ghrelin的细胞培养液，再进行缺氧因素干预。

1.5MMP测定 ①将细胞用Hanks液洗3遍，加入800 μl无血清培养液至培养皿中；再加入2 μl的罗丹明123，在37℃ CO2培养箱中培养30 min，然后用Hanks液洗3遍，加入1.5 ml无血清培养液，然后在激光共聚焦显微镜下采集细胞。②用激光共聚焦显微镜扫描已标记的细胞，每个细胞扫描200 s，然后测定每个标记细胞MMP值。在细胞培养皿中放置缺氧环对细胞进行缺氧处理，然后用激光共聚焦显微镜扫描缺氧后的细胞，同时测定每个标记细胞缺氧后MMP值。③记录缺氧前、后的最大值荧光值，作为被标记细胞缺氧前后MMP值。

1.7细胞上清液ET-1含量测定 分别取100 μl培养细胞上清液，按照ET-1测定试剂盒说明书处理上清液后应用放射免疫伽玛计数器检测。

1.8统计学处理 采用SPSS13.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组MMP变化 与对照组〔(35.46±3.08)Δφm〕比较，单纯缺氧组MMP水平〔(27.89±3.76)Δφm〕明显降低(P<0.05)。与单纯缺氧组比较，缺氧+Ghrelin组内皮细胞MMP水平〔(32.89±2.18)Δφm〕明显升高(P<0.05)。对照组和缺氧+Ghrelin组内皮细胞MMP水平无显著差别(P>0.05)。

2.2各组细胞培养液ET-1含量比较 单纯缺氧组上清液ET-1水平〔(113.65±11.98)pg/ml〕高于对照组〔(42.85±6.12)pg/ml〕(P<0.05)，缺氧+Ghrelin组上清液ET-1水平〔(68.21±8.18)pg/ml〕明显低于单纯缺氧组(P<0.05)。

2.3各组细胞培养液NO含量比较 单纯缺氧组〔(23.78±4.36)μmol/L〕、缺氧+Ghrelin组上清液NO水平〔(48.18±7.69)μmol/L〕明显低于对照组〔(59.38±9.28)μmol/L〕(P<0.05)，缺氧+Ghrelin组上清液NO水平明显高于单纯缺氧组(P<0.05)。

3 讨 论

血管内皮完整性对于机体保持内皮的生物学功能非常重要。血管内皮不仅是血液与组织间屏障，同时还具有多种其他功能，主要包括维持血管通透性，调节组织与血液间物质交换；合成和分泌一些血管活性因子，调节血管舒缩功能；参与机体炎症和免疫反应等功能。因此，血管内皮细胞损伤会导致内皮系统功能障碍，它是引起动脉粥样硬化的因素之一，同时其与高血压、冠心病、高胆固醇血症、心力衰竭、糖尿病等发生有关。因此，保护血管内皮和内皮细胞功能是目前防治心脑血管疾病的研究热点之一。内皮细胞受损主要会影响内皮依赖性舒张因子(EDRF) 和内皮依赖性收缩因子(EDGF)，如NO分泌减少或生物利用度降低，而ET-1等分泌增加等，NO可以维持内皮依赖性舒张活性，降低内皮系统通透性，进而抑制细胞迁移和增殖，同时还可以抑制血小板聚集及白细胞和单核细胞黏附。ET-1是引起血管收缩的物质，ET-1过多分泌对血管的影响主要为：长期收缩血管、促进有丝分裂及血小板和单核巨噬细胞聚集、粘附等的作用。当血管内皮损伤时，会导致氧自由基生成增加，NO分泌将减少，ET-1释放增多。NO和ET-1是在血管壁分泌的并发挥着非常重要作用，因此其异常会引发血管病变，从而会促进动脉粥样硬化、冠心病和高血压等心脑血管疾病的发生发展〔1〕。

线粒体是细胞内的一个具有非常重功能的细胞器，它是细胞进行呼吸、氧化磷酸化，产生能量的主要场所。MMP是评价线粒体功能的重要指标之一。MMP的功能正常与否直接影响线粒体进行氧化磷酸化产生三磷酸腺苷，因此MMP是维持线粒体功能正常所必需的重要条件之一。有研究表明，在许多缺氧、缺血性疾病的病理生理变化过程中，MMP会发生改变，从而导致线粒体肿胀，细胞色素C进入细胞质中，进而激活一些蛋白质系统，引起细胞凋亡。因此，细胞出现凋亡的早期重要表现之一就是MMP的下降〔2〕。

GHSR存在于人体多个器官组织，例如下丘脑、肾上腺、胃肠道等均有表达，在动静脉血管中也有表达。研究表明，Ghrelin具有生长激素/胰岛素样生长因子依赖和非依赖的心血管保护作用。特别是可以改善血管内皮功能，包括抑制血管内皮细胞凋亡、增加内皮型NO合酶表达、促进血管再生及抑制炎症反应等。研究表明，外源性Ghrelin可以抑制大鼠肺ET-1过表达，降低肺动脉压力〔4～7〕。本研究提示Ghrelin能够维持由缺氧引起的细胞因子水平变化，保护缺氧引起的内皮细胞线粒体功能改变，提高血管内皮细胞对缺氧的耐受，对缺氧引起的血管内皮细胞损伤起到保护作用。

4 参考文献

1马贵喜，李鸣皋，韩 磊，等.地尔硫卓对缺氧所致血管内皮细胞线粒体膜电位变化的保护作用〔J〕.海军总医院学报，2007;20(3)：129-31.

2陈淑娟，汪新宇，李海燕，等.PGC-1 对血管内皮细胞内线粒体生物合成的影响〔J〕.2010;30(5)：1114-6.

3黎兰芳，王云开.Ghrdin对血管紧张素n诱导的人脐静脉内皮细胞损伤保护作用的研究〔J〕.中国微循环，2008;12(5)：293-5.

4Wang Y，Narsinh K，Zhao L，etal.Effects and mechanisms of ghrelin on cardiac microvascular endothelial cells in rats 〔J〕.Cell Biol Int，2011;35(2)：135-40.

5Scares JB，Leite-Moreira AF.Ghrelin，des-acyl ghrelin and obestatin：three pieces of the same puzzle〔J〕.Peptides，2008;29(7)：1255-70.

6喻 卓，陈 鹏，杨桂梅，等.20(R)-人参皂苷Rg3抗血小板活化因子诱导血管内皮细胞损伤的保护作用〔J〕.昆明医学院学报，2011;(32)5：7-12.

7魏文华，胡 欣，贺 莉.淫羊藿苷对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用〔J〕.中国现代药物应用，2013;(7)32：232-3.