人IFN-γ基因启动子的克隆鉴定及功能分析

汤必奎 程 禹 翟素莲 刘小粉 胡明洁 吴守伟

(蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233030)

IFN-γ是由机体内活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的一种糖蛋白，具有抗感染、抗肿瘤活性和免疫调节作用，如活化巨噬细胞、提高MHCⅠ类和Ⅱ类分子的表达、促进抗原提呈等，在机体抗感染与免疫中发挥重要作用〔1～3〕。现有研究认为其主要通过JAK-STAT、PI3K等途径激活〔4，5〕，但近期有报道提示IFN-γ激活和其调控区域的DNA甲基化修饰相关，如在Th1/Th2细胞分化过程中的IFN-γ表达和调控区域甲基化状态相关〔6〕。DNA甲基化调控主要和基因启动子区域相关，高甲基化状态时基因沉默，而低甲基化状态时基因激活，所以为研究IFN-γ表达的表观遗传学修饰机制，本研究中首先克隆了启动子区域并进行功能分析和甲基化状态的鉴定，为后继研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1菌株、质粒和细胞E.coliDH5菌株为本实验室保藏；pGL3-basic和pRL质粒购自Promega公司；人胚肾来源细胞系HEK293T培养基为DMEM含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 μg/L链霉素，培养于37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)细胞培养箱。

1.2试剂 分子克隆所有试剂购自Takara公司；小量质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司；无内毒素超纯质粒小抽试剂盒购自Qiagen公司；细胞培养试剂和转染试剂Lipofectamin2000购自Invitrogen公司；荧光素酶检测试剂Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司；ploy I:C dsRNA购自Sigma公司；DNA 甲基转移酶Sss Ⅰ购自NEB公司；DNA合成和测序由Invitrogen公司完成；其他分析纯试剂购自上海国药有限公司。

1.3方法

1.3.1生物信息学分析 人IFN-γ基因序列(No：NC_000012.11)从美国国立生物技术中心数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)获得；启动子预测及转录因子分析利用在线数据库Promoter 2.0 Prediction Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)完成；甲基化分析利用MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)完成。

1.3.2引物设计和PCR扩增 根据生物信息学预测结果设计一对特异性引物(Invitrogen公司合成)，IFNγ-F：5′-CGACGCGTTTTCTACTGGGCAGTGCTGA-3′，IFNγ-R：5′-CCGCTCGAGCGTTTCCGAGAGAATTAAGC-3′。以人类来源的基因组为模板进行PCR扩增，反应条件为95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，循环30次。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶检测。

1.3.3荧光素酶载体的构建 扩增得到的700 bp产物凝胶电泳纯化回收后，用限制性内切酶MIuⅠ和XhoⅠ双酶切，再用PCR产物纯化试剂盒纯化。pGL3-Basic 质粒用MIuⅠ和XhoⅠ双酶切后使用胶回收试剂盒回收纯化。分别酶切纯化的扩增片段和质粒片段用T4 DNA连接酶连接后转化感受态E.coliDH5α细胞，先菌液PCR初步筛选阳性克隆，再通过双酶切和测序验证，即得到含有IFN-γ潜在启动子区域的luciferase报告载体，命名为pIFNγ。

1.3.4细胞转染和启动子活性的检测 HEK293T细胞按2×105铺板于48孔细胞培养板中，待生长至密度为70%～80%时，用pIFNγ报告质粒和内参照海肾荧光素酶(Renilla)报告载体pRL共转染，24 h后换为不完全培养基，再培养24 h按照Dual-Luciferase Reporter Assay System用化学发光仪检测荧光素酶的活性。每个样本进行3～4个平行孔实验，启动子活性以萤火虫荧光素酶(Luciferase)催化反应底物产生的荧光信号强度读值与内参照海肾荧光素酶(Renilla)催化产生的荧光信号强度读值的比值来表示，即相对荧光强度(RLA)。

1.3.5体外甲基化分析 1 μg的pIFNγ报告质粒用Sss Ⅰ于37 ℃处理30 min后，PCR产物回收试剂盒纯化，再用此质粒和pRL共转染HEK293T细胞，检测启动子活性。

1.4统计学方法 采用SPSS10.5 软件进行t检验。

2 结 果

2.1生物信息学分析 从NCBI数据库中获得IFN-γ基因序列(NC_000012.11)，截取从翻译起始点ATG后30 bp开始至上游5 000 bp的区域(即68556371-68553371)进行分析。首先用Promoter 2.0进行分析，提示前700 bp区域得分最高，再用TFSEARCH Search分析该区域存在大量转录激活因子结合位点，所以我们初步将该区域确定在翻译起始点ATG前-1～-688区域，具体序列见图1A。同时，对该区域做了转录因子结合位点分析，显示存在大量结合位点，以及该区域存在大量的可能甲基化CG位点，如图1B所示。

2.2pIFNγ载体构建 以正常成人外周血来源基因组为模板，IFNγ-F和IFNγ-R引物进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测可见成功扩增出IFN-γ基因启动子片段，与预计片段大小一致为700 bp左右(图2A)。将目的片段和pGL3载体连接转化后菌落PCR鉴定，可见有阳性克隆(图2B)，克隆提取质粒后MluⅠ和XhoⅠ双酶切可见700 bp插入目的片段(图2C)。将这两个克隆进行测序，结果和NCBI参考序列一致，说明含IFN-γ启动子区域的luciferase报告载体构建成功。

A：选定的启动子区域，下划线C为转录起始点，下划线ATG为翻译起始点；B：该区域的甲基化位点分析

2.3pIFNγ载体活性分析 为验证构建的pIFNγ载体是否有活性，将pIFNγ或pGL3空载体和内参照载体pRL共转染HEK293T细胞，48 h后检测相对荧光强度。pIFNγ可以显著启动luciferase活性(22.4±3.1)，而pGL3载体(1.1±0.2)和不转染的空细胞(0.2±0.1)不能启动luciferase活性，说明插入的IFN-γ启动子片段具有活性。同时，已知IFN-γ可被dsRNA诱导表达，进一步检测pIFNγ是否能被dsRNA polyIC激活，polyIC可显著增强IFN-γ启动子活性(81.7±2.4)，是加PBS的mock对照(25.5±3.9)的3倍左右，进一步说明pIFNγ构建的成功。

2.4DNA甲基化影响pIFNγ活性 从前面的生物信息学预测发现克隆的IFNγ启动子区域有潜在的甲基化位点，而甲基化是和基因表的的沉默相关。据此，本研究分析了pIFNγ载体甲基化后对IFNγ启动子活性的影响，当使用体外甲基化酶SSSI处理后，启动子活性下降达5倍(42.2±3.4 vs 8.9±1.3)，这和理论推断一致，也进一步验证了pIFNγ载体的功能。

A：PCR扩增目的片段，泳道1为扩增产物；B：菌落PCR鉴定转化克隆，泳道1～8为待鉴定菌落；C：双酶切鉴定菌落PCR阳性克隆，泳道1,2分别代表B中的5和7菌株；M：DL2000 DNA Marker

3 讨 论

病毒感染被宿主免疫识别后启动天然免疫应答和适应性免疫应答，其中IFN-γ是一个非常重要的抗病毒因子，其机制是通过JAK-STAT等途径激活，但新近的研究发现IFN-γ的表达和表观遗传学机制相关。表观遗传学是一类不涉及遗传物质改变的基因调节方式，发现其几乎存在于生物调控的所有环节，在发育、肿瘤发生等过程中都扮演着重要的作用，其中一个重要机制是DNA甲基化，高甲基化状态和基因沉默相关，而低甲基化则和基因激活相关〔7，8〕。本研究结果提示其具有启动活性，在激活剂dsRNA刺激下，活性显著上调，说明克隆的区域具有启动子活性。同时为了验证启动子活性是否和DNA甲基化相关，用SssⅠ体外甲基化后发现其活性显著下降，进一步验证克隆的区域具有活性。

4 参考文献

1Schoenborn JR,Wilson CB.Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses〔J〕.Adv Immunol，2007；96：41-101.

2Thiel DJ，le Du，Walter RL,etal.Observation of an unexpected third receptor molecule in the crystal structure of human interferon-gamma receptor complex〔J〕.Structure，2000；8(9)：927-36.

3Schroder K，Hertzog PJ，Ravasi T,etal.Interferon-gamma：an overview of signals，mechanisms and functions〔J〕.J Leukoc Biol，2004；75(2)：163-89.

4DeVries TA，Kalkofen RL，Matassa AA,etal.Protein kinase Cdelta regulates apoptosis via activation of STAT1〔J〕.J Biol Chem，2004；279(44):45603-12.

5Katagiri K，Ohnishi N，Kabashima K,etal.Crucial functions of the Rap1 effector molecule RAPL in lymphocyte and dendritic cell trafficking〔J〕. Nat Immunol，2004；5(10):1045-51.

6Jones BD，Chen JZ.Inhibition of IFN-γ transcription by site-specific methylation during T helper cell development〔J〕. EMBO J，2006；25(11)：2443-52.

7Law JA，Jacobsen SE.Establishing，maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals〔J〕.Nat Rev Genet，2010；11(3)：204-20.

8Das PM，Singal R.DNA methylation and cancer〔J〕.J Clin Oncol，2004；22(22)：4632-42.