凝血因子Ⅴ Leiden突变检测对肺血栓栓塞症的预测价值

赵永娟 赵凤芹 谭 平 石少敏

(吉林大学中日联谊医院呼吸内科，吉林 长春 130033)

肺血栓栓塞症(PTE)是肺栓塞(PE)最常见的类型〔1〕。由于PTE的临床症状极缺乏特异性，漏诊率、误诊率、致死率和致残率均较高，严重威胁人们的生命和健康。近年来，凝血因子Ⅴ(Factor Ⅴ，FⅤ) Leiden突变(FⅤL)被认为是形成PTE的重要遗传危险因素之一〔2～4〕。但是，该基因突变在欧美等西方国家研究较多，在亚洲等地研究较少。而且研究发现，该基因突变有显著的地域差异，在欧洲某些地区FⅤL发生率达到了15%〔5,6〕，而在亚洲、非洲人中极为罕见〔2〕。我国关于PTE与FⅤL相关性研究较少，东北地区未见相关报道。本研究拟探讨FⅤL在我国东北地区PTE诊断中的预测价值。

1 材料与方法

1.1对象 病例组：2011年1月至2013年5月就诊于吉林大学中日联谊医院的PTE患者81例，男性41例，女性40例，年龄23～88岁，平均(53.71±14.04)岁。对照组：中日联谊医院体检中心健康体检者81例，男性45例，女性36例，年龄 20～85岁，平均(51.76±14.62)岁。病例组及对照组均为在吉林省居住5年及5年以上的常住居民。两组性别构成及年龄无统计学差异。

纳入标准：PTE诊断标准参照中华医学会呼吸病分会制定的PTE诊断和治疗指南〔7〕及急性肺血栓栓塞症诊断治疗中国专家共识〔8〕。均经螺旋CT肺动脉造影(CTPA)和(或)核素肺灌注显像发现充盈缺损结合临床症状确诊。排除标准：①长骨骨折、严重脂肪组织挫伤或脂肪挤压伤患者合并肺栓塞；②分娩过程中及分娩后出现肺栓塞；③肿瘤患者合并肺栓塞。

参与研究的对象通过伦理委员会审查，尊重其知情同意权、隐私权、保密权、自主权。

1.2方法

1.2.1提取基因组DNA 受试者每人用EDTA管取外周静脉血2 ml，按DNA提取试剂盒说明提取有核细胞中的基因组DNA〔9〕。提取出的基因组DNA保存备用。

1.2.2PCR反应 采用PCR技术在50 μl反应体系中，以序列分别为：FⅤ-1: 5′-TCAGGCAGGAACAACACCAT和FⅤ-2:5′-GGTTACTTCAAGGACAAAATACCTGTAAAGCT作为引物，经35个循环扩增含有FⅤ基因相关片段，将PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，以确认PCR扩增片段为目的DNA片段。

1.2.3Hind Ⅲ限制性酶切 对确认扩增成功的FⅤ基因的PCR产物，用Hind Ⅲ限制酶在20 μl反应体系中进行酶切实验，再对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，最后用凝胶成像分析系统再次进行照相分析。

1.3统计方法 采用SPSS21.0软件，频数分布采用χ2检验分析；计量资料采用t检验。

2 结 果

2.1PCR扩增结果 PTE病例组和对照组的FⅤ基因PCR扩增产物大小均为241 bp的DNA片段(见图1)。

Marker:100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 500 bp;1～10:PCR产物;1～7:PTE患者;8～10:对照组；下图同

2.2Hind Ⅲ限制酶酶切结果 PTE病例组和对照组的FⅤ基因片段大小均为241 bp，均为野生型，无FⅤL。即FⅤ基因表型均为1691G/1691G，1691位点没有出现突变。见图2。

图2 Factor V 基因PCR 扩增产物经Hind Ⅲ限制酶酶切电泳图

3 讨 论

FⅤL是单一点突变，是指FⅤ基因10号外显子1691位点的核苷酸由腺嘌呤(A)替代了鸟嘌呤(G)。突变后凝血因子Ⅴ氨基酸序列506位的氨基酸由谷氨酰胺Gln替代了精氨酸Arg，使活化的凝血因子Ⅴ(凝血因子Ⅴa)分子上的活化蛋白C(APC)裂解位点发生改变，APC灭活凝血因子Ⅴa在Arg506位点位置后的Arg306位置完成，无法发挥其灭活凝血因子Ⅴa的作用〔10〕，导致凝血因子Ⅴa仍然具有促凝血活性，而对APC抗凝血活性产生抵抗，产生活化蛋白C抵抗(APCR)现象。APCR使血液的促凝系统和抗凝系统失衡，机体处于高凝状态，对血栓形成有明显的促进作用〔4，10，11〕。Ornstein等〔2〕研究发现，FVL是PTE最常见的遗传性病因。Shaheen等〔3〕通过近期的研究，证实了这一观点。在西方人群中，95%以上的APCR现象是由于FVL导致,说明FVL是PTE的一个重要遗传危险因子。

除遗传因素外，PTE高危因素还包括妊娠、肥胖、近期手术等获得性高危因素。国外研究发现，若FVL携带者合并有获得性高危因素，将使血栓形成的风险更高。Grody等〔12〕发现，凝血因子Ⅴ Leiden突变存在于20%的特发性静脉血栓形成患者中，而在静脉血栓形成的孕妇中达60%。

FVL突变的分布具有明显地域差异〔13〕，在欧洲某些地区FVL达到了15%〔5,6〕，而在西班牙人中不常见，在亚洲、非洲人中极少有FVL〔2〕。我国山东、上海、北京、新疆等地均有关于该基因突变的研究，均未发现FVL〔2,14～17〕，仅郑红等〔18〕在正常人群中发现该基因突变。

我国关于FVL与PTE相关性研究较少，东北地区未见相关报道。本研究也未发现FVL基因杂合子或纯合子突变，与国内多项研究结果一致，但不同于欧美等西方国家。考虑可能与以下因素有关：①FVL存在种族和地域差异性，在西方国家，FVL是白种人PTE最常见的遗传性病因，但这个位点的突变在我国PTE人群中尚未发现；②本研究选择的PTE患者例数较少，缺乏大样本研究，可能存在该基因突变未被发现；③国外的研究资料提示多种凝血因子联合突变在血栓形成和血栓发展中起着关键的作用，而不是单一凝血因子突变〔19〕。可能同时存在凝血因子多种突变对血栓形成有更好的预测价值。

4 参考文献

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3Shaheen K, Alraies MC, Alraiyes AH，etal. Factor V Leiden:how great is the risk of venous thromboembolism 〔J〕?Cleve Clin J Med,2012;79(4):265-72.

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