吲哚美辛对受损颈动脉再内皮化的作用及机制
2014-09-13张晓芸金成文
李 鑫 张晓芸 金成文 成 敏
(潍坊医学院基础医学院,山东 潍坊 261053)
吲哚美辛已广泛应用于心血管疾病的治疗〔1〕,但其机制目前尚不清楚。传统观点认为损伤周边的内皮细胞可通过迁移、增殖修复内皮缺损。但成熟内皮细胞是终末分化细胞,其增殖潜能有限,修复能力并不理想〔2〕。内皮祖细胞(EPCs) 是成熟血管内皮细胞的前体细胞,正常情况下在外周循环血中的数量较少。受各种因素的刺激动员后(如血管内皮受损后),外周血中EPCs的数量迅速增加,进而EPCs向血管内皮细胞分化,在内皮损伤后的修复过程中起到重要作用〔3,4〕。本研究着重观察吲哚美辛对损伤颈动脉再内皮化的作用,并从EPCs的角度探讨其作用机制。
1 材料方法
1.1实验动物 健康成年雄性SD大鼠,体重250 g左右,由潍坊市解放军第八十九医院动物实验室提供。
1.2主要试剂与药品 Histopaque-1083梯度离心液及伊文氏蓝(Evens blue)(美国Sigma公司);EGM-2(美国Lonza公司);吲哚美辛钠(上海源叶生物科技有限公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基苯四氮唑蓝(MTT)(北京中杉);纤维连接蛋白(Fn)及DAPI(德国Roche);Matrigel 基质胶(美国BD公司);改良的Boyden小室及8 μm聚碳酸醋微孔滤膜(江苏海门麒麟医用仪器厂);Forgety导管(Edwards Lifesciences,Unterschleissheim,Germany)。吲哚美辛钠的配制:体内实验:使用生理盐水配制成5 mg/ml的储存液,过滤后储存于4℃冰箱内备用。体外实验:使用EGM-2培养液配制成5 mg/ml的储存液,过滤后储存于4℃冰箱内备用。
1.3方法
1.3.1动物模型制备及分组 健康SD大鼠随机分为模型组及吲哚美辛处理组。采用球囊法制备大鼠颈动脉损伤模型:10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉,分离左侧颈总动脉。从颈外动脉远心端切口将2F Forgety导管插入,充分充盈球囊,向左右各转动3次,损伤局部颈总动脉。手术结束后,吲哚美辛处理组腹腔注射吲哚美辛(10 mg/kg),每2 d一次,连续2 w;模型组注射等剂量无菌生理盐水。2 w后处死大鼠,分离颈总动脉,取材。
血管内膜修复的评价:通过对伊文氏蓝染色区域的测量,评价损伤血管内皮的再内皮化,即血管内皮的修复程度。实验大鼠处死前30 min,尾静脉注射0.5%伊文氏蓝(20 mg/kg)。过量麻醉并处死大鼠,取损伤侧颈总动脉,拍照。伊文氏蓝染区域为内皮剥脱区。血管内皮的再内皮率=(1-染色区域的面积/血管总的区域面积)×100%。
1.3.2EPCs 分离、培养 参照本课题组前期方法进行〔5〕。颈椎脱臼法处死大鼠,无菌取出大鼠四肢长骨,PBS反复冲洗骨髓腔至无色。将骨髓细胞悬液1 000 r/min 离心5 min,弃上清,PBS 清洗2次后3 ml PBS 重悬,以1∶1比例小心加到梯度离心液表面,700 r/min 离心30 min,吸取中间白色细胞层,加PBS洗涤2次,弃上清,用EGM-2培养基重悬细胞,将其接种于预先包被有Fn的培养瓶中,含5% CO2,37℃培养箱中培养。5 d后更换培养液,以后每隔3 d更换一次培养液。传至第三代EPCs(晚期EPCs) 时,细胞可以用于后续实验。
1.3.3增殖能力检测 体外诱导培养的晚期EPCs,待铺满瓶底90%左右,胰酶消化,按照1.5×104/ml的密度均匀种植于96孔板内,每孔100 μl。24 h后待细胞贴壁,用0.625、0.312 5、0.1562 5 mg/ml(分别相当于大鼠体内注射浓度的1/8,1/16及1/32)的吲哚美辛处理EPCs24 h。药物处理完成后,小心弃去上清,每孔加入10 μl MTT溶液+含2%小牛血清的M199培养液,37℃继续培养4 h。小心弃去培养液,每孔加入100 μl二甲基亚砜,摇床上低速振荡10 min,使结晶充分溶解。使用酶联免疫检测仪OD 490 nm处测量各孔的吸光度值。
1.3.4黏附能力检测 晚期EPCs,胰酶消化后,按照2×104/ml的密度,均匀种于六孔板内,每孔2 ml。待细胞铺满瓶底大约60%~70%时,用不同浓度的吲哚美辛处理EPCs24 h。胰酶再次消化收集细胞,离心后计数,分别以2×104/ml的密度接种于事先Fn包被的24孔板中,每孔1 ml,30 min后弃上清,PBS清洗3次,显微镜下拍照计数,每组3复孔,每孔5个视野。
1.3.5迁移能力检测 EPCs药物处理后,胰酶消化收集单个细胞,离心后用含有2%胎牛血清的培养液重悬并计数,以2×104/ml的密度接种于Boyden小室的上室,每孔200 μl,下室为与上室相同的培养液,小室中间为8 μm聚碳酸醋微孔滤膜。置于含有5%CO2的37℃培养箱中。12 h后,取出中间滤膜,棉签涂抹掉上层未迁移的细胞,PBS清洗3次后,DAPI染色,显微镜下观察并计数。
1.3.6成血管能力检测 药物处理后的EPCs,胰酶消化离心收集单个细胞,EGM-2培养基重悬后计数,以2×105/ml的密度接种于事先包被有Matrigel基质胶(100 μl/孔)的96孔板内,每孔100 μl细胞悬液,10 h后,显微镜下观察并拍照。
1.4统计学方法 采用SPSS13.0软件,组间比较行t检验或ANOUA分析。
2 结 果
2.1吲哚美辛对体内颈动脉损伤模型血管修复能力的影响 吲哚美辛加速了大鼠受损颈总动脉内皮的修复。在第2周,吲哚美辛处理组大鼠颈总动脉受损区域再内皮化率明显高于模型组大鼠(P<0.01)。见图1。
2.2吲哚美辛对晚期EPCs增殖能力的影响 与对照组相比,吲哚美辛处理24 h后,0.625 mg/ml浓度组EPCs增殖能力明显增强(P<0.01),0.312 5 mg/ml 浓度组EPCs增殖能力也有所增加(P<0.05)。
2.3吲哚美辛对晚期EPCs粘附能力的影响 不同浓度吲哚美辛分别处理EPCs 24 h后,与对照组相比各浓度组EPCs粘附能力均明显增强(P<0.01)。
2.4吲哚美辛对晚期EPCs迁移能力的影响 与对照组相比,吲哚美辛处理24 h后,0.312 5 mg/ml浓度组EPCs迁移能力增加(P<0.05)。
2.5吲哚美辛对晚期EPCs成血管能力的影响 与对照组相比,吲哚美辛处理后各浓度组成血管能力明显增强,形成血管腔数目明显增加(P<0.01),细胞之间形成的连接更加紧密、长侧支明显。见图2。
图1 吲哚美辛对受损血管内皮修复的影响
图2 吲哚美辛对EPCs成血管能力的影响
3 讨 论
吲哚美辛为非甾体类抗炎药,可选择性抑制环氧化酶而减轻前列腺素的合成,抑制炎症反应。有研究发现,吲哚美辛可通过抑制局部的炎症反应对脑缺血再灌注损伤模型起到保护作用,具有与自由基清除剂相同的效果〔6,7〕。
本文动物模型实验结果表明,吲哚美辛能够明显增加受损血管的再内皮化率。EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,存在于骨髓、循环血液及脐带血等组织中,正常情况下在外周循环血中的数量较少。在某些生理或病理条件下,骨髓中的EPCs可从骨髓动员至外周血,外周血中EPCs 的数量迅速增加,归巢到血管损伤部位,增殖分化为成熟内皮细胞,通过补充代替凋亡、缺失的内皮细胞促进受损内皮的修复。因此有人认为,外周循环中EPCs的功能与数量决定着损伤血管的内皮修复程度。
本研究发现,处理EPCs 24 h后,三种不同浓度的吲哚美辛均能够促进EPCs的增殖、迁移、黏附及成血管功能,其中以0.625 mg/ml、0.312 5 mg/ml浓度作用最强。文献报道,大鼠血容量占体重7%左右〔8〕,动物体外实验中,大鼠血液中瞬时血药浓度最高约为注射浓度的7%,此浓度介于本次体外实验中使用浓度0.625~0.312 5 mg/ml区间范围。据此我们推测,一定浓度范围内的吲哚美辛,在短时间内能够促进EPCs增殖、黏附、迁移及成血管功能,这可能是颈动脉损伤模型中吲哚美辛促进受损血管修复的原因之一,详细的机制有待进一步研究。
4 参考文献
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4Zhu JH,Tao QM,Chen JZ,etal.Statins contribute to enhancement of the number and the function of endothelial progenitor cells from peripheral blood〔J〕.Acta Physiol Sin,2004;56(3):357-64.
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6王 岩,许美玲.吲哚美辛对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响〔J〕中国老年学杂志,2009;29(14):1788-9.
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