血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂对血管外膜成纤维细胞亚群增殖和胶原合成的影响

刘 培 李 雪 焦 展 邵铁梅 仵 陶 温 昕 陈晓威 安胜军

(河北省高校生物反应器与蛋白类药物开发应用技术研发中心 河北化工医药职业技术学院，河北 石家庄 050026)

血管外膜成纤维细胞的增殖、迁移及转化在血管重构的发生发展中扮演着重要角色。血管损伤后发生的管壁结构重塑是血管重建后再狭窄、动脉粥样硬化等多种心血管疾病发病的共同病理基础〔1〕。An等〔2〕曾报道血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能够刺激血管外膜成纤维细胞中内皮素-1的合成和释放，并促进胶原生成，从而导致胶原沉积。前期研究表明〔3,4〕成纤维细胞可分为纺锤形细胞(SC)和圆形细胞(RC)两个亚群，并发现两细胞亚群在细胞增殖、迁移和内皮素-1的合成方面存在显著性的差异。本实验旨在比较AngⅡ及其受体拮抗剂氯沙坦(Los)和PD123319的作用下，血管外膜成纤维细胞的两种亚群在细胞增殖和胶原合成方面的异同，探索两种细胞亚群在血管病理生理过程中的不同作用。

1 材料与方法

1.1实验用动物与主要试剂 SPF级SD大鼠，雄性，6～8周龄，购自河北医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(冀) 2008-1-003。胎牛血清(FBS)购自Lonza BioWhittaker公司；DMEM/F12培养基和0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白(BSA)、Ang Ⅱ和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液购自Sigma公司；兔抗鼠Ⅰ型胶原单克隆抗体、兔抗鼠β-actin单克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP 购自Epitomics公司；引物购自上海生工生物技术有限公司；ECL显色液购自博彩公司；dNTP、TaqDNA聚合酶购自Promega公司；所用引物由上海生工生物技术有限公司根据设计合成，见表1。

表1 各基因引物序列长度及退火温度

1.2方法

1.2.1血管外膜成纤维细胞亚群培养与鉴定〔3〕SD大鼠断头处死，无菌条件下取胸主动脉，清洗后于手术镜下纵向剖开血管腔，刮去血管内膜和中膜，剩下薄层的血管外膜，剪成约1 mm3小块，将组织块均匀铺于培养皿上，置37 ℃、50 ml/L二氧化碳(CO2)培养箱中培养，次日补加适量待培养液继续培养，细胞生长达80%融合状态时胰酶消化，采用克隆环法〔5〕进行单克隆细胞培养，获得RC亚群和SC亚群，实验用细胞为第3～5代成纤维细胞亚群。

1.2.2成纤维细胞纯度鉴定 为了确认成纤维细胞亚群无内皮细胞、平滑肌细胞和白细胞的污染，采用免疫荧光染色和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)两种方法鉴定〔2〕。

1.2.2.1免疫荧光染色鉴定细胞纯度 以结蛋白为平滑肌细胞标记、第Ⅷ因子(vWF)为内皮细胞标记、波形蛋白(vim)为非特异性细胞标记，以成纤维细胞为细胞模型，进行免疫荧光染色。DAPI染细胞核，置荧光显微镜下观察结果。

1.2.2.2RT-PCR纯度鉴定 以β-actin为内参，vWF为内皮细胞标记物，肌球蛋白重链(MHC)和Des为平滑肌细胞标记物，CD8为白细胞标记物，设计并合成相关引物，引物序列及退火温度如表1所示。分别提取大鼠血管外膜组织和成纤维细胞亚群RNA，经反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行梯度PCR，循环体系为1.25 UTaq聚合酶，20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2和20 nmol/L上下游引物。循环程序如下:95 ℃初始化5 min，95℃变性1 min，48～56℃梯度退火1 min 30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后溴乙啶染色，凝胶成像系统捕获图像。

1.2.3细胞亚群测定 将长至80%融合的两细胞亚群用胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，生理盐水漂洗1次，离心并弃上清后，加入0.5 ml生理盐水重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.2.4MTT法检测细胞增殖活性 以1.0×107/L接种于96孔培养板，每孔200 μl，次日换无血清DMEM培养过夜，使其生长同步化。实验分为6组，con为空白对照组、Los为氯沙坦组、PD为PD123319组、Ang Ⅱ为AngⅡ(1.0×10-7mol/L)组、Ang Ⅱ+Los为(Ang Ⅱ+Los)组、Ang Ⅱ+PD为(Ang Ⅱ+PD123319)组。首先用100 μmol/L的Los或PD123319预处理30 min，之后加或不加Ang Ⅱ，继续培养72 h后检测吸光度值(A值)。细胞增殖率(%)=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。

1.2.5免疫印迹〔6，7〕检测Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)的表达 实验分组同1.2.4，培养24 h后提取蛋白。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转蛋白于PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭，TBST洗涤，分别经CollagenⅠ的一抗、二抗孵育后，ECL试剂显像。再利用清除缓冲液清除PVDF膜上已结合的一抗和二抗，重新经β-actin一抗、二抗孵育后，再次显像，作为内部参照。X-胶片曝光显影，扫描。

1.3统计学处理 使用GraphPad Prism5.0 软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1成纤维细胞亚群形态学观察及纯度分析 倒置显微镜下观察发现，成纤维细胞亚群从形态上可分为两个亚群：RC亚群和SC亚群〔3〕。RC亚群和SC亚群均无白细胞标记物CD8和内皮细胞标记物vWF的表达，平滑肌细胞标记物Des和MHC亦未见表达；相同实验条件下，血管组织中各标记物均有表达，其中β-actin为内参，见图1，图2。

2.2细胞亚群分析 SC有2个峰，而RC只有1个峰，也就是说，SC有2个直径，RC只有1个直径，这与从倒置显微镜下观察的结果一致，即从形态学上将成纤维细胞分为RC和SC。

2.3细胞亚群增殖活性分析 与自身对照相比，Ang Ⅱ可促进两细胞亚群的增殖：对SC亚群的增殖率达14.9%，而对RC亚群的增殖率高达27.3%(P<0.01)。单独应用Los或PD123319对两细胞亚群的增殖差异无统计学意义(P>0.05)。当Ang Ⅱ分别与Los或PD123319联合应用时，Ang Ⅱ对两细胞亚群的增殖作用表现出显著性差异。SC亚群：Ang Ⅱ的促增殖作用受到抑制。RC亚群：氯沙坦显著性抑制了Ang Ⅱ的促增殖作用，抑制率高达-24.2%(P<0.01)，PD123319对Ang Ⅱ的促增殖作用没有显著性影响，与单独应用Ang Ⅱ的增殖率无显著性差异。见表2。

2.4Western印迹法检测细胞亚群Collagen Ⅰ的表达 以两细胞亚群为模型，经氯沙坦或PD123319单独用药后与空白组相比，Collagen Ⅰ的合成差异无统计学意义(P>0.05)。经Ang Ⅱ作用后，Collagen Ⅰ的合成均有不同程度增加，其中RC亚群Collagen 的合成增加有统计学意义(P<0.01)。与Ang Ⅱ组相比，氯沙坦预处理后，显著抑制了Ang Ⅱ诱导的RC亚群Collagen Ⅰ的表达(P<0.01)，而对SC亚群Collagen Ⅰ的表达无明显影响；PD123319预处理后，对SC和RC Collagen Ⅰ的表达均无明显影响。见表3。

图中DAPI染细胞核(蓝色)，A、B、C分别用平滑肌细胞标记物结蛋白、内皮细胞标记物第vWF和成纤维细胞标记物波形蛋白染色

1～13：Marker,vWF,组织，vWF,SC,vWF,RC,CD8,组织，CD8，SC,CD8，RC,WHC，组织，MHC,SC,MHC,RC,Des，组织，Des，SC,Des,RC

组别纺锤形细胞OD值圆形细胞OD值空白对照组0.382 0±0.0290.398 9±0.025氯沙坦组0.390 8±0.0280.409 5±0.030PD123319组0.367 6±0.0300.382 0±0.016AngⅡ组0.439 1±0.0050.490 8±0.0081)AngⅡ+Los组0.407 0±0.0510.333 4±0.0203)AngⅡ+PD组0.396 8±0.0170.508 2±0.0242)

表3 Western印迹法检测Collagen Ⅰ的表达±s)

3 讨 论

外膜成纤维细胞异常增殖及胶原合成是不良血管重塑的重要病理变化，也是高血压维持、恶化的基础〔8,9〕，是在各种外界刺激的作用下，细胞外信号经过细胞内信号传递细胞到达核内，诱导一系列与成纤维细胞增殖相关的基因表达，启动细胞周期，从而推动成纤维细胞分裂、增殖以及胶原沉积。因此，抑制成纤维细胞的增殖和胶原沉积是抗不良血管重塑的基本策略。Ang Ⅱ可引起血管收缩、血压增高、交感神经系统兴奋、醛固酮分泌促进水钠潴留，还致细胞生长增殖，细胞外基质成分合成增加，促进其他生长因子和生物活性物质释放，在心肌、血管组织的病理性重构、顺应性下降、功能失代偿的过程中起着重要作用〔12〕。研究发现，不同浓度Ang Ⅱ(10-7～10-9)mol/L对细胞亚群的增殖能力有不同程度的促进作用，其中Ang Ⅱ 10-7mol/L对SC亚群的增殖活性无显著性影响(增殖率6.8%，P>0.05)，而对RC亚群的增殖作用有显著促进作用(增殖率30.5%，P<0.01)。本实验结果显示氯沙坦作为Ang Ⅱ1型受体拮抗剂能够阻断Ang Ⅱ对RC亚群的增殖促进作用，而Ang Ⅱ Ⅱ型受体拮抗剂PD123319 的这种作用不明显，说明对于RC亚群，Ang Ⅱ主要通过Ang Ⅱ1型受体来介导此作用，而Ang Ⅱ对SC亚群的增殖能力无显著影响。

本研究结果表明在RC亚群中氯沙坦能显著性地阻断Ang Ⅱ刺激下的 Ⅰ型胶原的合成，而对SC亚群Ⅰ型胶原的表达无显著影响；PD123319对两细胞亚群I型胶原表达的差异均无统计学意义。

综上所述， SD大鼠血管外膜成纤维细胞亚群，可分为SC亚群和RC亚群，并从形态学说明了成纤维细胞亚群的异质性。结合以往研究，提示两细胞亚群在血管的重建和修复过程中发挥不同作用，SC亚群可能在维持血管稳定及血管正常结构和功能中发挥重大作用；而RC亚群可能在血管新生内膜形成、不良血管重塑和血管再狭窄等病变中扮演了重要角色。本实验只在离体细胞水平进行了初步研究，在整体病理生理过程中的作用特点，还有待进一步证实。

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