重组人血管内皮抑素和长春瑞滨对人肺腺癌裸鼠移植瘤放射增敏作用的实验研究

程小峰 张蓓蓓 高春玲 叶性景 张雅雅 丁 园 章志勇

非小细胞肺癌在世界范围内都是常见病。肺癌患者的预后都很差，5年存活率只有13%。要提高非小细胞肺癌患者的生存率，我们需早期诊断，早期治疗。

重组人血管内皮抑素是分子量为20 kD的纤维素18因子的羧基端短肽。有研究发现[1-2]，重组人血管内皮抑素能够抑制移植瘤(非小细胞肺癌，黑色素瘤，胰腺癌等)的生长，并且能够诱导内皮细胞凋亡。在临床试验中[3]非小细胞肺癌患者接受重组人血管内皮抑素联合顺铂治疗，CBR 为 82.4%。有研究证实重组人血管内皮抑素有照射增敏作用[4]。

长春瑞滨是1种半合成的长春新碱类化疗药[5]，在有丝分裂时阻止微管的聚集。Sarkar等[6]研究显示长春瑞滨对头颈肿瘤有放射增敏作用。

重组人血管内皮抑素和长春瑞滨均具有放射增敏作用，本研究试图探讨两者联合对于照射的增敏是否存在协同作用，并探讨重组人血管内皮抑素和放射的最佳结合时机。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和细胞株

雄性裸鼠，4-5周龄，体重20 g左右，购自厦门大学实验动物中心。实验药品和试剂：DMEM培养基，(Gibco公司)；长春瑞滨，(法国皮尔法伯制药公司)；重组人血管内皮抑素，(山东先声麦得津生物公司)。细胞株为973细胞株，厦门大学抗癌研究中心惠赠。

1.2 实验方法

1.2.1 人肺腺癌裸鼠模型的建立 将呈指数增长的973细胞消化后制成浓度为3×106/mL个细胞的悬液。每只鼠右下肢大腿皮下注入0.1 mL细胞悬液，隔日观察，待移植瘤长足够大小入组。

1.2.2 实验分组 将48只裸鼠随机分为6组：对照组、重组人血管内皮抑素组、长春瑞滨组、长春瑞滨联合重组人血管内皮抑素和放射组、重组人血管内皮抑素联合放射组、单照组。

1.2.3 放射方法 采用Varian 600直线加速器6MV-X线放射。将荷瘤裸鼠装入一自制的有机玻璃盒内，并将其用橡皮圈固定在一塑料板上，肿瘤暴露在正中，裸鼠其他部分采用铅块遮挡，肿瘤表面放置1.5 cm有机玻璃板，在直线加速器下进行放射。肿瘤直径长至0.5～0.8 cm时分组，第一批于给药第1天开始放射。第二批于给药第7天开始放射，放射剂量均为10 Gy。

1.2.4 给药方法 根据实验分组和裸鼠体重计算给药剂量，采用腹腔注射给药方法，长春瑞滨2 mg/kg，放射前24 h给药；重组人血管内皮抑素20 mg/kg·d，用生理盐水稀释。根据实验分组方法和每只裸鼠体重计算给药剂量，然后腹腔注射已经稀释好的药液，对照组注射同等体积的生理盐水。当肿瘤直径增长至0.5 cm时开始用药，每天1次，连续14天。

1.2.5 评价方法 分组后观察荷瘤鼠的一般情况，实验采用盲法，隔日由专人用游标卡尺测量移植瘤的最长径( A )及其垂直径( B )和高(C)，并按公式V=π/6·A·B·C计算肿瘤体积。

当每只裸鼠肿瘤的体积增长至用药时肿瘤体积的两倍时为实验终止点。绝对肿瘤生长延缓时间(absolute growth delay，AGD)=TR-TC(TR 为单纯放射组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数，TC为对照组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数)。规格化肿瘤生长延缓时间(normalized growth delay，NGD)=TL-TG(TL为联合治疗组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数，TG为单纯药物组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数)；增敏系数(EF)=NGD/AGD，EF>1 提示有放射增敏效应。

1.3 统计学方法

采用origin软件绘制肿瘤生长曲线，应用SPSS 11.5软件进行统计学分析，采用mann-whitney u检验。

2 结果

2.1 第1天放射荷瘤鼠的一般情况

分组治疗后随时间的推移，对照组小鼠进食、活动未见异常，5～6只小鼠右下肢肿瘤局部皮肤溃烂；而单独放射和联合治疗组小鼠活动及进食未受影响，2～3只小鼠右下肢肿瘤皮肤溃烂。

2.2 第1天放射荷瘤鼠肿瘤生长曲线

对照组、长春瑞滨组肿瘤生长情况相似；10 Gy放射组从第8天开始，肿瘤水肿期过去，生长较对照组受到不同程度抑制(P=0.003)，药物加放射组肿瘤生长较对照组生长抑制明显，尤以重组人血管内皮抑素联合10 Gy最明显(P=0.000)，重组人血管内皮抑素和长春瑞滨联合放射组生长曲线位于10 Gy放射和重组人血管内皮抑素联合10 Gy之间，较对照组抑制明显(P=0.001)，从给药第12天开始，重组人血管内皮抑素联合放射组较单照组肿瘤有轻度生长抑制(P=0.048)，重组人血管内皮抑素+长春瑞滨+10 Gy组与单照组肿瘤生长情况相似。根据各组小鼠肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(图1)。

图1 照射第1天时各组肿瘤的生长曲线

2.3 第1天放射肿瘤生长延缓时间及增敏系数

重组人血管内皮抑素的EF 值为1.1。重组人血管内皮抑素和长春瑞滨联合治疗组增敏系数为0.1，即无明显增敏作用。由此可见长春瑞滨的作用和重组人血管内皮抑素的作用发生了拮抗，使两药各自的放射增敏作用消失(表1)。

组别 肿瘤倍增时间/天AGDNGDEF对照组 2.0+ 1.4---10 Gy 11.0±1.19--重组人血管内皮抑素 10±1.58--长春瑞滨 3±1.21--重组人血管内皮抑素+10 Gy 20.0±1.118101.1长春瑞滨+重组人血管内皮抑素+10 Gy 12±1.11010.1

表2 第7天照射时重组人血管内皮抑素与长春瑞滨对肺腺癌的放射增敏作用

2.4 第7天放射荷瘤鼠的一般情况

分组治疗后随时间的推移，对照组小鼠进食、活动未见异常，5～6只小鼠右下肢肿瘤局部皮肤溃烂；而单独放射和联合治疗组小鼠活动及进食未受影响，2～3只小鼠右下肢肿瘤皮肤溃烂。

2.5 第7天放射荷瘤鼠肿瘤生长曲线

对照组、长春瑞滨组肿瘤生长情况相似；10 Gy放射组从第12天开始，肿瘤水肿期过去，生长受到不同程度地抑制(P=0.005)，从第12天起，重组人血管内皮抑素加放射组肿瘤生长较对照组生长抑制明显(P=0.029)，重组人血管内皮抑素和长春瑞滨联合放射组生长曲线位于10 Gy放射组和重组人血管内皮抑素联合10 Gy组之间，从第20天起，重组人血管内皮抑素和长春瑞滨联合放射组较对照组肿瘤生长抑制明显(P=0.036)，重组人血管内皮抑素联合放射组较10 Gy放射组肿瘤有轻度生长抑制(P=0.027)，重组人血管内皮抑素+长春瑞滨联合10 Gy组较10 Gy放射组肿瘤生长抑制明显(P=0.023)。根据各组小鼠肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(图2)。

2.6 第7天放射荷瘤鼠肿瘤生长延缓时间及增敏系数

重组人血管内皮抑素的EF值为2。重组人血管内皮抑素和长春瑞滨联合放射组的增敏系数为1，即无明显增敏作用。由此可见长春瑞滨的作用和重组人血管内皮抑素的作用发生了拮抗，使两药原本的放射增敏作用消失(表2)。

图2 照射第7天时各组肿瘤的生长曲线

3 讨论

随着新一代化疗药的出现，放化同步治疗已成为中晚期非小细胞肺癌的标准治疗模式，与单纯放射相比，放化疗结合能提高肿瘤的控制率并能延长患者的生存时间，但与放射结合的最佳的化疗药物及降低放化疗毒性的方案仍在研究中。

重组人血管内皮抑素直接抑制血管生成，同时上调其他血管生成抑制剂的表达[7]。重组人血管内皮抑素下调HIF-1a的同时，通过上调HIF-1an(HIF-1a的直接拮抗剂)来加强抗血管生成作用。重组人血管内皮抑素在治疗中通过与其他的信号通路相互作用产生抗血管生成协同作用。包括各种调节内皮细胞生长的过程，如诱导内皮细胞凋亡，使内皮细胞周期停滞，使内皮细胞迁移减少等。重组人血管内皮抑素下调的因子包括HIF-1a，NF-KB，Ets-1和STATs，这些都是抗凋亡基因的上调调节因子，STATs，NF-KB，和AP-1通过调节细胞周期素如细胞周期素D促进增值。重组人血管内皮抑素下调这些信号通路分子，同时下调Id家族的转录因子，这与观察到的重组人血管内皮抑素使细胞周期停滞是一致的。同时，重组人血管内皮抑素的抗内皮细胞迁移效果可能源于抑制MAPK并且下调myc。

总之，重组人血管内皮抑素作为一个血管控制程序的整合角色，最终的效果是加强重组人血管内皮抑素的抗血管生成效果。所有这些研究显示血管生成抑制可能是重组人血管内皮抑素抑制肿瘤的主要因素[8]。

长春瑞滨是NSCLC最常用的化疗药物之一，通过与微管蛋白结合，使微管蛋白发生空间构象改变，成为螺旋状而无法聚合成微管，进而抑制有丝分裂时纺锤体的形成，使细胞停滞于有丝分裂的中期，诱导细胞凋亡[9-10]。

本实验研究发现单纯放射组肿瘤生长受到不同程度的抑制，药物加放射组肿瘤生长受到抑制，尤以重组人血管内皮抑素联合10 Gy最明显。重组人血管内皮抑素联合放射时，当放射时间位于重组人血管内皮抑素用药第1天时效果轻微，而放射位于重组人血管内皮抑素用药第7天时效果明显。陈明等[11]研究发现，重组人血管内皮抑素用药第7～9天，肿瘤血管正常化程度最好，此阶段称为血管正常化窗口期。我们实验的结果验证了这一结论。

重组人血管内皮抑素和长春瑞滨联合放射组的增敏系数为1和0.1，即无明显的增敏作用。由此可见长春瑞滨的作用和重组人血管内皮抑素的作用发生了拮抗，使两药原本的放射增敏作用消失。本实验结果显示长春瑞滨和重组人血管内皮抑素的放射增敏作用有拮抗作用。

细胞内微管蛋白分为α、β 2个亚型，是细胞骨架的重要组成部分。人类细胞中存在着6种β微管蛋白同型体，其中3型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ)与作用于微管的化疗药物敏感性有最密切的关系。Pascal Sève等研究发现tubulin Ⅲ过表达与长春瑞滨治疗反应关系密切。Mozzetti’s和Pascal Sève研究认为β-tubulin Ⅲ可能是抗微管药物的一个耐药机制之一[12]。另外，有研究发现RLIP76是长春瑞滨的转运剂，通过把长春瑞滨泵出细胞，减少长春瑞滨对肿瘤细胞的毒性。这是长春瑞滨的耐药机制之一[13].这些长春瑞滨的耐药机制可能是两药的拮抗机制之一。

重组人血管内皮抑素联合长春瑞滨和顺铂方案已在临床广为应用，临床研究显示此方案在肺癌治疗中效果良好，此方案的机制阐述较少。

长春瑞滨对人非小细胞肺癌的放射增敏作用，其机制主要是使肿瘤细胞的细胞周期集中在G2/M期。放射的机制是通过DNA损伤和使细胞周期停滞于G2期，和长春瑞滨的作用机制产生协同作用。长春瑞滨的分子机制类似泰素和长春碱类，都是通过结合微管蛋白，干扰微管的运动和聚合[6]。

顺铂除了直接的细胞毒性还有潜在增强放射诱导细胞杀伤作用。顺铂作为放射增敏剂增加肿瘤细胞核DNA的损伤[14-16]。

重组人血管内皮抑素的放射增敏机制尚未明确，有研究[17]发现重组人血管内皮抑素能够提高肿瘤内部的氧含量，对放射增敏主要通过减少肿瘤微血管密度，减少不成熟的血管，增加主要血管的血流。

重组人血管内皮抑素的作用靶点主要针对新生血管。而长春瑞滨的作用靶点是细胞内的微管蛋白。顺铂影响的是肿瘤细胞的DNA。三者的放射增敏机制并未见交叉，我们的研究长春瑞滨和重组人血管内皮抑素放射增敏作用产生拮抗效应，机制有待探讨若增加顺铂是否会改变这种拮抗效应有待于进一步研究。

[1] Li N，Zheng D，Wei X，et al.Effects of recombinant human endostatin and its synergy with cisplatin on circulating endothelial cells and tumor vascular normalization in A549 xenograft murine model〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138(7)：1131-1144

[2] Lee TY，Tjin Tham Sjin RM，Movahedi S，et al.Linking antibody fc domain to endostatin significantly improves endostatin half-life and efficacy〔J〕.Clin Cancer Res，2008，14(5)：1487-1493.

[3] 龙建林，李 潞，黄媚娟，等.恩度联合第 3代含铂化疗方案治疗 55例晚期非小细胞肺癌的临床观察〔J〕.肿瘤，2010，30(2)：156-159.

[4] Mauceri HJ，Hanna NM，Beckett MA，et al.Combined effe-cts of angiostatin and ionizing radiation in antitumour therapy〔J〕.Nature，1998，394(6690)：287-291.

[5] Schwarzenberger P，Fariss A，Linares L，et al.Dose escalation of once weekly oral vinorelbine concurrent with weekly split dose hypofractionated chest radiation for palliation of advanced non-Small cell lung cancer： a phase I/II study〔J〕.Am J Med Sci，2011，341(6)：454-459.

[6] Sarkar SK，Patra NB，Goswami J，et al.Comparative study of efficacy and toxicities of cisplatin vs vinorelbine as radiosensitisers in locally advanced head and neck cancer〔J〕.J Laryngol Otol，2008，122(2)：188-192.

[7] Shichiri M，Hirata Y.Antiangiogenesis signals by endostatin〔J〕.FASEB，2001，15(6)： 1044-1053.

[8] Abdollahi A，Hahnfeldt P，Maercker C，et al.Endostatin’s Antiangiogenic signaling network〔J〕.Mol Cell，2004，13(5)：649-663.

[9] Fukuoka K，Arioka H，Iwamoto Y，et al.Mechanism of the radio sensitization induced by vinorelbine in human non-small cell lung cancer cells〔J〕.Lung Cancer，2001，34 (3)： 451-460.

[10] Goa KL，Faulds D.Vinorelbine.A review of its pharmacological properties and clinical use in cancer chemotherapy〔J〕.Drugs Aging，1994，5(3)： 200-234.

[11] 陈 明，彭 芳，王 谨，等.重组内皮抑素对肿瘤血管结构和乏氧改善作用的实验观察〔J〕.中华放射肿瘤学杂志，2011，20(1)：69-72

[12] Sève P，Isaac S，Olivier Trédan，et al.Expression of class Ⅲ β-Tubulin is predictive of patient outcome in patients with Non-Small Cell Lung Cancer receiving vinorelbine-based chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2005，11：5481-5486.

[13] Stuckler D，Singhal J，Singhal SS，et al.RLIP76 transports vinorelbine and mediates drug resistance in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Res，2005，65(3)：991-998.

[14] Raeisi E，Aghamiri SM，Bandi A，et al.The antitumor efficiency of combined electrochemotherapy and single dose irradiation on a breast cancer tumor model〔J〕.Radiol Oncol，2012，46(3)：226-232.

[15] 饶创宙，魏启春，金梅良，等.三维适形放疗联合长春瑞滨加顺铂同步化疗治疗Ⅲ期非小细胞肺癌的临床研究〔J〕.实用癌症杂志，2008，23(6)：609-612.

[16] 彭烈娅.长春瑞滨联合顺铂治疗三阴性乳腺癌的临床研究〔J〕.实用药物与临床，2012，15(12)：792-794.

[17] Zhou J，Wang L，Xu X，et al.Antitumor activity of Endostar combined with radiation against human nasopharyngeal carcinoma in mouse xenograft models〔J〕.Oncol Lett，2012，4(5)： 976-980.