急性早幼粒白血病细胞ATRA耐药株HL- 60R、NB4R的构建及鉴定

张亚芬，张莹，缪凤琴，张建琼

(东南大学医学院 病原生物学与免疫学系，发育与疾病相关基因教育部重点实验室，江苏 南京 210009)

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓系白血病中的M3亚型，占所有急性髓系白血病的10%～15%[1]。全反式维甲酸(all- trans retinoic acid，ATRA)联合以蒽环类药物为主的化疗方案是临床上APL诱导缓解的首选疗法[2- 4]，而ATRA治疗时耐药性的产生是导致其治疗失败的主要原因。本实验以ATRA为诱导药物，采用浓度递增间歇诱导法建立了APL细胞的ATRA耐药株HL- 60R、NB4R，并对耐药细胞的生物学性状进行了初步探讨。该细胞系的建立为深入探讨人急性早幼粒细胞白血病细胞ATRA耐药机制提供了工具细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 ATRA(Sigma公司)、依托泊苷(etoposide，VP- 16，江苏恒瑞医药股份有限公司)、硫酸长春新碱(vincristine sulfate，VCR，浙江海正药业股份有限公司)、阿糖胞苷(cytarabine，Ara- C，辉瑞制药有限公司)、多柔比星(doxorubicin，ADM，辉瑞制药有限公司)、RPMI- 1640培养基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)、链霉素(Thermo Scientific公司)、CCK8(Dojindo公司)。

1.1.2 细胞 人APL细胞系HL- 60购自中国科学院细胞库，人APL细胞系NB4由南京市鼓楼医院惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HL- 60、NB4细胞以RPMI- 1640培养基(含10%胎牛血清、青霉素120μg·ml-1、链霉素100μg·ml-1)于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。

1.2.2 ATRA耐药细胞株的诱导 根据文献报道采用浓度递增间歇诱导法进行耐药细胞株的构建[5- 6]：取对数生长期细胞，在含10-9mol·L-1ATRA培养基中培养48h；以普通培养基培养2～3代后提高ATRA浓度1倍，如此反复，最终诱导出在含10-6mol·L-1ATRA培养基中仍能保持增殖和分化状态的细胞系，分别命名为HL- 60R、NB4R，且细胞始终培养于含10-6mol·L-1ATRA培养基中用于实验。

1.2.3 HL- 60R、NB4R细胞对ATRA耐药性的鉴定 以HL- 60R细胞为例，设置4组：HL- 60、HL60+ATRA、HL- 60R、HL- 60R+ATRA组，以每孔5000个细胞接种于96孔板，培养48h后每孔加入10μl CCK8溶液，继续培养4h，酶标仪读取吸光度值，并计算各组细胞的存活率。

1.2.4 生长曲线测定 以HL- 60、HL- 60R细胞为例，取对数生长期的HL60、HL60R细胞，以每孔1000个细胞接种至6孔板，分别在普通培养基或含10-6mol·L-1ATRA培养基中培养，于第1、2、3、4、5、6天进行细胞计数，绘制生长曲线，并根据Patterson公式计算细胞的群体倍增时间。

1.2.5 耐药谱分析 以HL- 60R细胞为例，取对数生长期HL- 60及HL- 60R细胞，以每孔5000个细胞接种于96孔板，每孔加入不同浓度的各化疗药物(VCR、ADM、VP- 16、Ara- C)，药物终浓度参照临床使用时的血浆峰浓度(peak plasma concentration，PPC)[7]，培养48h后每孔加入10μl CCK8溶液，继续培养4h，酶标仪读取吸光度值并计算各化疗药物对细胞的抑制率。

参照药敏试验评价标准[8]，若药物对细胞的抑制率﹥50%，代表细胞对药物敏感；若药物对细胞的抑制率为30%～50%，代表细胞对药物部分耐受；若药物对细胞的抑制率﹤30%，代表细胞对药物耐受。

1.3 统计学处理

采用SPSS18.0统计软件进行分析，样本均数比较用两独立样本t检验，P<0.05则差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 构建HL- 60R、NB4R耐药细胞株

本实验采用浓度递增间歇诱导法，历时4.5个月，成功建立了HL- 60、NB4细胞相应的ATRA耐药株，并以CCK8法对其ATRA耐药性进行了鉴定(图1)；且耐药株经冻存复苏后的生长状态良好，耐药性保持稳定。

2.2 HL- 60R、NB4R细胞的生物学性状

2.2.1 细胞形态学观察 光镜下(未染色)观察发现(图2)，亲代及耐药细胞均悬浮生长，耐药细胞体积有所增大，且大小不一；此外HL- 60细胞呈单个生长，而相应的耐药株HL- 60R则出现少量成团生长现象。

图1HL- 60R和NB4R细胞的ATRA耐药性鉴定

Fig1IdentificationofHL- 60RandNB4Rcells’ATRAresistance

图2光镜下的的HL- 60和HL- 60R细胞

Fig2HL- 60andHL- 60Rcellsunderlightmicroscope

2.2.2 HL- 60R、NB4R细胞的生长曲线 亲代及耐药细胞在相同培养基下增殖情况有一定差异：在普通培养基下耐药细胞的生长速度减慢，生长曲线的斜率减小(图3)，群体倍增时间延长(HL- 60为21.86h，HL- 60R为27.5h，NB4为20.75h，NB4R为25.94h)；在含ATRA培养基中亲代细胞培养72h后几乎全部死亡，而耐药细胞则生长良好。

图3HL-60R和NB4R细胞的生长曲线

Fig3ThegrowthcurvesofHL-60andHL-60R

2.3 HL- 60R、NB4R细胞呈现多药耐药性

从图4的耐药谱来看，参照药敏试验的评价标准，HL- 60R细胞对VP- 16、ADM这两种化疗药物具有耐药性，对VCR、Ara- C具有部分耐药性；而NB4R细胞对这4种化疗药物均具有部分耐药性。

3 讨 论

目前临床上APL治疗的首选方法是ATRA联合蒽环类药物为主的化疗，该方法能够使患者的初治完全缓解率达80～95%[2，9- 10]，是肿瘤诱导分化疗法最成功的模式。然而，用ATRA进行治疗时20%～30%的APL患者会产生耐药反应，在完全缓解后3～6个月内复发，且再次缓解后的3年总体生存率仅为50%左右，严重影响了ATRA的疗效，甚至导致治疗失败[11- 12]。因此，ATRA耐药性的产生是目前临床上APL化疗失败的主要原因，所以研究ATRA的耐药机制并寻求逆转耐药的有效措施是目前APL研究的一大方向。而构建理想的耐药细胞系是研究耐药细胞生物学变化、耐药发生机制以及探索逆转耐药的新型药物的重要基础。

图4HL-60R和NB4R细胞的耐药谱

Fig4Cross-drugresistanceprofilesofHL-60RandNB4R

本研究采用浓度递增间歇诱导法，历时4.5个月，成功建立了具有多药耐药特征的ATRA耐药细胞株HL- 60R、NB4R。这两株耐药细胞在含10-6mol·L-1ATRA培养基中生长良好，且经冻存复苏后耐药性仍保持稳定。耐药细胞株的诱导过程实际上是筛选细胞的过程，由于细胞的异质性，大部分对药物敏感的细胞被杀死，仅有少数不敏感的细胞存活下来并得以扩增。

比较亲代细胞及耐药细胞的生物学特性发现，与亲代细胞相比耐药细胞体积有所增大，且大小不一；对VP- 16、ADM、VCR、Ara- C等其它化疗药物也产生了一定程度的耐药性，即耐药细胞株HL- 60R、NB4R具有多药耐药特征。

此外，通过绘制细胞生长曲线并计算细胞的群体倍增时间发现，相较于亲代细胞耐药细胞株HL- 60R、NB4R的生长增殖速度减慢、群体倍增时间明显延长。研究表明肿瘤细胞的群体倍增时间越短，其对化疗药物越敏感，疗效越好；反之，细胞群体倍增时间延长，表明其对化疗药物的敏感性降低[13]。这与我们的结果相一致。

综上所述，本研究构建了APL细胞的ATRA耐药株HL- 60R、NB4R，其耐药性稳定且具备一定的多药耐药性状。这两株ATRA耐药细胞的成功构建为进一步从细胞和分子水平研究APL细胞的多药耐药机制提供了有效的细胞模型，为寻找APL细胞多药耐药的逆转策略及筛选或开发新的APL治疗药物等提供了必要的实验材料，同时对于预防和延缓APL临床耐药性的发生、提高APL的治疗效果具有重要意义。

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