人溶菌酶cDNA克隆与CHO/dhfr-细胞中的分泌性表达

孙东业 张 涛 朱贵明 田黎明 张英海 杜静平

(佳木斯大学医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

溶菌酶可水解细菌胞壁的肽聚糖，从而使细菌溶解，并有激活补体和促吞噬、抗感染、抗肿瘤和免疫调节等作用，具有潜在的临床价值〔1,2〕。溶菌酶广泛存在于各种体液、外分泌液和吞噬细胞溶酶体中，而要大量获得，基因工程是首选。大肠杆菌表达系统具有表达水平高、操作简单、周期短、成本低等优点。但人溶菌酶(hLYZ)在原核中表达会引起宿主菌“自杀”性死亡，且翻译后缺乏修饰，包涵体的复性操作复杂，获得足量天然蛋白较困难〔3,4〕；而在酵母和霉菌中表达存在与大肠杆菌类似的问题〔5〕。哺乳动物细胞表达系统尽管表达量可能欠缺，但可以实现真正的分泌表达，使产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质更接近，药用更可靠〔6〕。本研究构建真核可溶性表达载体pSecTag2/Hygro-hLYZ，利用脂质体共转染技术在CHO/dhfr-细胞中表达，为工程化、规模化生产hLYZ奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 人胎盘组织由北京大学妇产儿童医院手术室提供。CHO-K1/ dhfr-细胞系株及带有 pSV2-DHFR质粒的DH5α菌株：由中国科学院遗传所徐玖瑾教授提供；分泌型真核表达载体pSecTag2/HygroB及阳性对照质粒PSA/Hygro购于invitrogen公司；pMD18-T vector载体、dNTP混合液、限制性内切酶Xho I、EcoR V，T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司； DNA快速提取试剂盒、DNA片段胶回收试剂盒购自博大泰克； IPTG、X-Gal、核酸染料购自北京江晨生物技术公司；总RNA快速抽提纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.2方法 从新鲜的人胎盘组织中分离提纯总RNA，经RT-PCR，用合成的特异引物进行PCR扩增，胶回收产物用T4连接酶将其连接到pMD18-T载体上，转化入DH5α感受态细胞，获得阳性克隆。把连接在pMD18-T载体上的hLYZ cDNA片段用限制性内切酶EcoR V和Xho Ⅰ双酶切，再将回收的目的条带连接到真核分泌性表达质粒pSecTag2/HygroB上。经菌液PCR和双酶切鉴定，hLYZ因成功连接到表达载体上。利用脂质体技术,将含hLYZ基因的pSecTag2/HygroB-hLYZ 载体和pSV2/dhfr-2DNA 质粒(3∶1)与脂质体按4∶6比例转染CHO/dhfr-中。经添加潮霉素B抗生素和氨甲蝶呤(MTX)并撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷) 双筛选下,获得了24株阳性细胞克隆体。RT-PCR验证hLYZ基因已整合入基因组中，并有其mRNA的转录。随机挑选一株扩大培养并换用无血清培养基,在MTX加压下扩增DHFR 基因；随DHFR共转染的编码hLYZ的基因序列也得到扩增，进而使目的蛋白表达量得到提高，收集细胞上清培养液经Ni+-Resin过柱纯化。纯化后的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚酰胺基凝胶(SDS-PAGE)和Western印迹鉴定。

2 结 果

2.1hLYZ cDNA的克隆

2.1.1hLYZ基因的克隆与鉴定 电泳显示PCR扩增获得了特异性目的产物。 将电泳回收到的RT-PCR产物与pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选，白色菌落为重组转化体。菌落PCR初步筛选鉴定后，再进行酶切鉴定。用限制性内切酶EcoR V和Xho I对重组转化体进行双酶切鉴定与菌液PCR检测结果一致，都产生同样大小(434 bp)预期片段。初步筛选得到阳性克隆。见图1A。将获取的阳性重组质粒pMD18-T-hLYZ进行测序，进一步证实PCR结果。

2.1.2人溶菌酶真核表达载体的构建 pMD 18-T-HLYZ克隆质粒与pSecTag2/Hygro真核表达载体分别用EcoR V和Xho I进行双酶切、连接、转化大肠杆菌DH5α细胞。接种于Amp/LB平板培养基，经抗生素筛选挑取单个菌落于Amp/LB液体培养基中培养，菌液PCR检测为阳性后用博大泰克质粒小量提取试剂盒提质粒。质粒用EcoR V、Xho I进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳R约430 bp的清晰单一条带，初步判定重组质粒构建成功。见图1B。

2.2人溶菌酶基因在CHO/dhfr-细胞中的分泌性表达 将构建的人溶菌酶基因重组真核分泌性表达质粒pSecTag2/HygroB-hLYZ与pSV2-DHFR质粒利用脂质体共转染技术导入CHO/dhfr中，潮霉素B筛选得到的阳性克隆经MTX加压扩增，收集细胞上清培养液经Ni+-Resin过柱纯化，纯化蛋白液经SDS-PAGE 和Western印迹鉴定结果，见图1C、图1D。

A：pMD18-T-hLYZ载体的菌落PCR及酶切鉴定分析，M：MakerⅢ 由上到下为4 500、3 000、2 000、1 200、800、500、200 bp，1: pMD18-T-hLYZ重组质粒经EcoR V和Xho Ⅰ双酶切，2： pMD18-T-hLYZ重组质粒菌落PCR产物；B：pSecTag2/Hygro-hLYZ重组质粒菌液PCR及酶切鉴定分析，M1: 1 kb DNA Ladder，由上到下依次为10、8、6、3.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、750、500、250 bp，M2: MakerⅢ，1：pSecTag2/HygroB质粒EcoR V酶切，2: pSecTag2/Hygro-Hlyz(6F)重组质粒EcoRV和Xho1双酶切，3:菌液PCR产物hLYZ片段，4:菌液PCR空白对照(未加引物)；C：融合蛋白hLYZ-6×His在CHO/dhfr-细胞中的表达、纯化后结果，M: SDS-PAGE低分子量标准蛋白Maker,由上到下依次为97、66.2、43、31、20.1、14.4 kD，1：Hygro-DHFR/CHO纯化上清，2：LYZ-DHFR/CHO纯化上清；D：Western印迹鉴定结果，M: SDS-PAGE低分子量标准蛋白Maker，1、2: LYZ-DHFR/CHO培养上清，3、4:Hygro-DHFR/CHO培养上清

图1各实验电泳结果

3 讨 论

本实验设计了人溶菌酶成熟蛋白130个氨基酸cDNA的特异引物及基因两端与表达载体相对应的酶切位点,考虑到融合表达蛋白融合片段对目的蛋白活性的影响，又在引物5'端加上肠激酶酶切位点序列，表达的融合蛋白纯化后经肠激酶作用，把N-和C-端多余序列切除，可使残留氨基酸不影响HLYZ的空间结构。另外在下游引物靠近酶切位点处增加了一个碱基，以保证插入片段下游氨基酸翻译的读码正确。最终成功获得了长度为390 bp目的片段，虽在105位置有变异(C→U)，但由于是密码子的第三位碱基，GGU并不影响甘氨酸的翻译，所得hLYZ一级结构没有变化，说明载体克隆成功。本实验利用脂质体共转染剂技术，在潮霉素最佳筛选浓度的作用下，获得了24株抗性单克隆。为进一步获得高表达蛋白细胞株生产制备人用溶菌酶药物做了上游技术水平的开发研究。

根据实验结果，还将进一步做些工作：①对筛选得到的阳性单细胞克隆要进一步做蛋白的表达定量测定，筛选高表达蛋白细胞株；②对所得到的人溶菌酶融合蛋白进行肠激酶酶切及生物活性的鉴定。

4 参考文献

1刘淑鑫，李苌清，袁新华，等. 溶菌酶医学应用研究概况〔J〕. 中国医药指南,2011；9(21)：226-8.

2Lenander-Lumikari M,Mansson-Rahemtulla B,Rahemtulla F. Lysozyme enhances the inhibitory effects of the peroxidase system on glucose metabolism of Streptococcus mutans〔J〕. J dent Res，1992；71 (3)：484-90.

3谢 磊，孙建波，张世清，等. 大肠杆菌表达系统及其研究进展〔J〕. 华南热带农业大学学报， 2004；10 (2)：16-20.

4欧阳萍，雷连成;，吕 爽，等. 人溶菌酶基因的原核表达及其生物学活性〔J〕. 中国生物制品学杂志，2009；22 (6)：544-7.

5胡 乔，赵凌侠，唐克轩. 在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究〔J〕. 上海交通大学学报(农业科学版)， 2008；26(3)：233-6.

6陈 茜. 新型牛溶菌酶基因的重组真核质粒构建及活性研究〔D〕. 四川大学硕士论文，2007.