不同提取工艺制备的五年生种植人参对小鼠免疫功能的影响

洪 凌 狄良娇 刘姝男 赵 晶 睢大筼 徐华丽 姜英子 洪 铁

(延边大学医学院麻醉系，吉林 延吉 133002)

人参对神经系统〔1,2〕、心血管系统〔3,4〕、血液系统〔5,6〕、消化系统〔7〕、内分泌系统〔8〕、免疫系统〔9,10〕及泌尿生殖系统〔11〕都有调节作用。目前国际市场上，美国、加拿大、日本、韩国等发达国家已把人参作为食品应用，中国在20世纪90年代之前部分人参制品被允许作为食品在市场上销售，但2002年卫生部发布《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》，人参被列入《可用于保健食品的物品名单》中，被局限于保健品食用范围，为了更好的利用人参资源，2012年卫生部年根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》，批准人参(人工种植)为新资源食品。为探讨人参(人工种植)食用对免疫系统的调节作用，本文拟探讨人参原粉、水提取物及乙醇提取物对正常成年小鼠免疫功能影响的研究。

1 材料与方法

1.1实验动物 ICR小鼠，清洁级，由吉林大学实验动物中心提供，动物合格证号：(吉)2008-0005。

1.2实验药品 实验用生晒参(5年生)产于吉林抚松县。人参原粉系200目的细粉；人参水提物系两次水煎煮提取，过滤，浓缩，烘干得人参干粉末，提取率为40.09%，其中人参总皂苷含量约为0.99%，人参多糖含量为7.54%；人参醇提物系70%乙醇加热回流提取人参粗粉，过滤，浓缩，烘干得人参浸膏，提取率为30.8%，其中人参总皂苷含量约为2.33%，人参多糖含量为0.76%。上述三种实验药品均由长春中医药大学研发中心生物工程实验室提供，批号分别为：20101216、20110407、20110331。

1.3给药方式及方法 将100只正常成年ICR小鼠随机分为10组，即：对照组，5年生种植人参原粉小、中、大剂量(0.35、0.75、1.4 g生药/kg)组，5年生种植人参水提物小、中、大剂量(0.35、0.75、1.4 g生药/kg)组，5年生种植人参醇提物小、中、大剂量(0.35、0.75、1.4 g生药/kg)组，每组10只。各组小鼠均每天灌胃给药 1次，连续3 个月。

1.4实验试剂 胎牛血清，中美合资兰州民海生物工程有限公司，批号：20081028； RPMI-1640培养液，Gibco公司；青霉素、链霉素，华北制药股份有限公司；噻唑蓝(MTT)， Fluka公司；二甲基亚砜(DMSO)，天津市大茂化学试剂厂。

1.5实验仪器 Bio-rad 680型酶标仪，美国伯乐Bio-rad公司生产；CO2培养箱为日本三洋(Sanyo)公司生产； TGL-16G-A型低温离心机，上海安亭科学仪器厂生产。

1.6细胞株 L929细胞株由吉林省肿瘤医院提供。

1.7方法

1.7.1正常成年小鼠免疫器官测定 取ICR小鼠100只，随机分为十组，每组10只，组别与给药剂量如表1所示，实验组每日1次连续灌胃给药90 d，正常组灌服同体积蒸馏水末次给药24 h后，称量体重，摘出胸腺及脾，称重，计算胸腺指数和脾脏指数，公式如下：胸腺指数=胸腺重(mg)÷体重(g)；脾脏指数=脾重(mg)÷体重(g)。

1.7.2正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的测定 取ICR小鼠100只，组别与给药剂量如表2所示，给药组每日一次连续灌胃给药90 d，正常灌服同体积蒸馏水末次给药24 h后，每鼠腹腔注射5% 鸡红细胞0.4 ml，8 h后将动物处死，仰位固定于鼠板，消毒腹部，剪开皮肤，经腹腔注入生理盐水2 ml，转动固定板1 min，然后抽取腹腔液1 ml滴于干净载玻片上，每片0.2 ml，共2片，放在垫有湿纱布的搪瓷盒中，置于37℃孵箱中温育30 min，取出玻片，用生理盐水漂洗，以除去未贴片的细胞。晾干，以丙酮-甲醇液(1∶1)固定5 min，再用4%姬姆萨-瑞特氏染色液染色3 min，用蒸馏水漂洗，晾干。在显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，按下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数：吞噬百分率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数÷200个巨噬细胞×100%，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数÷200个巨噬细胞。

1.7.3正常自然杀伤细胞活性的测定 取ICR小鼠100只，给药组每日1次连续灌胃给药90 d，正常灌服同体积蒸馏水末次给药24 h后，每日1次，末次给药1 h后处死小鼠，浸入75%乙醇中约2 min，置于超净工作台中无菌开腹，取脾脏，放入盛有5 ml Hank液的平皿中清洗，除去血液。吸去Hank液，用砂面载玻片研磨，制成脾细胞混悬液。将制得的脾细胞混悬液1 500 r/min离心2次，添加红细胞裂解液2 ml在37℃恒温水浴静置5 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清，Hank’s洗涤两次，用10%的胎牛血清RPMI-1640培养液将脾细胞的细胞数调整成浓度为1×107/ml的细胞悬液，此细胞做为效应细胞，备用。将传代培养的L929细胞在试验前1 d换液，实验时用0.25%的胰蛋白酶1 ml消化2 min，轻轻吹打细胞使其完全从壁上脱落，加入完全RPMI-1640培养液，终止消化，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，将沉积细胞重悬于含10%小牛血清RPMI-1640培养液中，调细胞浓度至2×105/ml，即备用的NK细胞的靶细胞。将准备好的靶细胞悬液加入96孔平底培养板中，0.1 ml/孔，然后放入5% CO2的37℃培养箱中培养1 h，使靶细胞贴壁成一单层细胞，向每孔加入0.1 ml效应细胞(使效靶比例为50∶1)，每样品设4个复孔，靶细胞对照孔加入完全RPMI1640培养液 0.1 ml，放置于5% CO2的37℃培养箱培养20 h，倾去上清液，用37℃生理盐水轻轻灌满各孔，反复洗涤3次，以除去效应细胞及被杀死而脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分，每孔加0.1 ml 0.1%的中性红染液，5% CO2的37℃培养箱培养30 min，弃去染液，再用生理盐水洗涤3次后，每孔加入0.1 ml细胞裂解液(50%醋酸和50%乙醇配制)，使吞噬中性红的靶细胞溶解，释放出中性红，轻轻摇匀。在酶标仪波长570 nm处测定光密度(OD)值，并计算杀伤率，公式：杀伤率(%)=(靶细胞OD值-实验组OD值)÷靶细胞OD值×100%。

1.7.4正常小鼠脾淋巴细胞增殖的测定 取ICR小鼠100只，组别与给药剂量如表3所示，给药组每日一次连续灌胃给药90 d，末次给药1 h后，处死动物。将小鼠于超净工作台无菌开腹，取脾脏放入盛有5 ml Hank液的平皿中清洗，去除血液，吸去Hank液，用带有磨面的载玻片进行研磨，并用Hank液轻轻冲洗筛网，制成脾细胞悬液，2%台盼蓝试验证实细胞存活率>95%。将制得的细胞悬液1 500 r/min离心，弃上清，添加红细胞裂解液2 ml，在37℃水浴上静置5 min，1 500 r/min离心，弃上清，用Hank液洗2次，用10%的胎牛血清RPMI-1640培养液将细胞数调成5×106/ml，接种至96孔细胞培养板，每孔180 μl，置于5% CO2的37℃恒温培养箱中培养4 h后，每孔加入刀豆素A(ConA)(终浓度5 μg/ml)或脂多糖(LPS)(终浓度10 μg/ml)各10 μl，继续培养48 h，每孔加入浓度为5 mg/ml的噻唑蓝(MTT)溶液10 μl，继续培养4 h，轻轻吸去培养液后，加入二甲基亚砜(DMSO)溶液100 μl，振荡10 min，于酶标仪波长为570 nm处测定光密度(OD)值，计算增殖率，公式如下： 增殖率(%)=实验组OD值÷对照组OD值×100%。

1.7.5正常小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子的测定 取ICR小鼠100只，按表3所示组别及剂量进行分组，给药组每日1次连续灌胃给药90 d，末次给药后1 h处死小鼠，按上述“对正常小鼠淋巴细胞增殖反应的影响”中方法制备淋巴细胞，将制备好的淋巴细胞接种至96孔细胞培养板，每孔190 μl，置于5% CO2的37℃恒温培养箱中培养4 h后，每孔加入ConA(终浓度5 μg/ml)10 μl，继续培养48 h，小心取上清，备用，采用ELISA方法测定上清液中的分泌细胞因子白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ的水平。

1.7.6正常小鼠血清IgG产生的测定 取ICR小鼠100只，按表3所示组别及剂量进行分组给药组每日1次连续灌胃给药90 d，实验结束前7 d，腹腔注射20%绵羊红细胞(SRBC)0.2 ml初次免疫，处死动物前再次注射20% SRBC 0.2 ml免疫小鼠。处死动物前禁食12 h，取血，制备血清，采用ELISA法检测血清中IgG含量。

1.8统计学方法 应用SPSS10.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1对正常成年小鼠胸腺、脾脏重量及脾脏淋巴细胞增殖率的影响 与对照组比较，人参水提物大剂量组和人参醇提物中、大剂量组均可使正常成年小鼠胸腺、脾脏重量明显增高(P<0.05)，人参原粉、人参水提物和人参醇提物各剂量组刺激下促进淋巴细胞增殖活性的趋势。见表1。

2.2人参对各组小鼠吞噬率、吞噬指数及自然杀伤率的影响 与对照组比较，人参水提物大剂量组和人参醇提物大、中剂量组有增加吞噬率、吞噬指数及自然杀伤率的趋势。见表2。

2.3人参对各组小鼠IL-2、 IFN-γ、IgG产生的影响 见表3。

表1 人参对正常成年小鼠胸腺、脾脏重量及脾脏淋巴细胞增殖率的影响

表2 人参对正常成年小鼠吞噬率、吞噬指数及自然杀伤率的影响

表3 人参对正常成年小鼠IL-2、 IFN-γ、IgG产生的影响

与对照组比较，人参水提物和人参醇提物大剂量组均可使正常成年小鼠IL-2、 IFN-γ(P<0.05)。人参原粉、人参水提物和人参醇提物各剂量组具有增加IgG含量的趋势。

3 讨 论

本实验结果显示，人参原粉及提取物具有增加正常成年小鼠胸腺、脾脏指数，增强腹腔巨噬细胞吞噬活性，提高自然杀伤细胞的杀伤率，促进脾淋巴细胞增殖、提高特异性抗SRBC抗体水平的趋势；人参水煎煮提取物及人参乙醇提取物大剂量组，显著增加正常成年小鼠胸腺、脾脏指数。水煎提取物、乙醇提取物大剂量组显著增加正常成年小鼠脾淋巴细胞培养液上清中的细胞因子IL-2及INF-γ的含量；提示人参原粉及提取物可影响正常成年小鼠的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫功能等，能提高机体免疫力，具有较好的免疫功能增强作用。

本实验所用人参水提物含有人参总皂苷为0.99%，人参多糖为7.54%，而人参醇提物含人参总皂苷含量为2.33%，人参多糖为0.76%。实验结果发现，人参水提物和醇提物均有提高免疫功能的作用或趋势，提示人参提高免疫功能的作用可能与人参皂苷或人参多糖有关。

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