膜型基质金属蛋白酶1在胃癌及癌周组织中的表达及临床意义

赵典朋 徐芸中 贾丽燕 王晓玲 姚兴国

(潍坊医学院附属医院肝胆外科，山东 潍坊 261000)

胃癌发病原因目前尚不完全明确，可能与多种基因的异常有关。基质金属蛋白酶(MMPs)被认为与多种恶性肿瘤的发生和浸润有关〔1〕， 膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)是MMPs家族中非常重要的成员，可能参与肿瘤的增殖、凋亡、浸润、转移以及血管形成等多个环节。本研究对原发胃癌及癌旁正常黏膜进行免疫组化和PCR分析，并分析不同MT1-MMP水平与临床特征的关系。

1 材料和方法

1.1一般资料 收集我院2007年1月至2009年12月行胃癌手术切除的病例110例，所有病例均经病理证实为原发性胃癌；男66例，女44例，年龄60～71〔平均(57.5±5.8)〕岁。其中腺癌49例，包括乳头状腺癌、管状腺癌与黏液腺癌等；未分化癌20例；黏液癌(即印戒细胞癌)16例；特殊类型癌25例，包括腺鳞癌、鳞状细胞癌、类癌等。按照UICC临床分期标准，Ⅰ期34例(30.90%)，Ⅱ期29例(26.36%)，Ⅲ期23例(20.90%)，Ⅳ期24例(21.81%)。入选标准：①本次治疗属首次治疗，之前未行放化疗及手术治疗；②患者无身体其他部位的恶性肿瘤；③术后均依据病理类型及分期进行足疗程化疗；④无血液系统的疾病及其他免疫性疾病。

1.2免疫组化 采用免疫组化三步法检测石蜡切片组织中胃癌和胃癌瘤旁组织中MT1-MMP的表达情况。新鲜手术标本经甲醛固定、石蜡包埋、蜡块成型后，以连续切片方式，切成4～5 μm厚的切片，抗原修复，37℃孵育后加入一抗(兔抗人单克隆抗体MT1-MMP，购自中杉金桥生物公司)过夜。预试验后，设定最佳实验浓度为1∶100。二抗Envinsion system(丹麦DAKO公司)。实验结果由两位以上主治医师以上级别病理科医师单独阅片，并计算分值。MT1-MMP染色为胞质染色，以染色的面积大小以及染色的程度进行评分，0分：阳性面积为0，1分：阳性面积<10%,2分：阳性面积10%～50%,3分：阳性面积51%～80%，4分：阳性面积>80%。染色强度：1分弱阳性，染色为淡黄色；2分中阳性，染色为黄色，仔细辨认可见到棕黄的表现；3分强阳性，染色为棕黄色。总评分采用面积乘以强度，所得分值即为该标本的最后得分。以4分为界，≤4分为低表达组，以>4分为高表达组。

1.3RT-PCR 取胃癌组织及癌旁正常黏膜组织块50～100 mg，研磨成粉末，1 ml Trizol 抽打匀浆，氯仿、异丙醇法抽提RNA，DEPC处理水溶解RNA。RNA变性电泳观察18 s、28 s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度。在20 μl体系中，加入1 μg总RNA,1 μl oligo dT(500 μg/ml )，RNase-Free水，70℃温育10 min后立即冰浴冷却，继续加入4 μl 5倍缓冲液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl dNTPs，混匀后42℃保温2 min，加入1 μl( 200 U)的反转录酶，42℃继续温育50 min。70℃15 min灭活反转录酶。mRNA反转录成cDNA后可以储存在-20℃条件下。PCR引物由上海敏芯生物技术公司合成，3′-5′:CATCCATGACAACTTTGGTATC,5′-3′:CCCCATAAAGTTGCTGGATG。反应条件为94℃ 2 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min 为第一步1个循环；94℃ 45 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min为第二步30个循环；72℃ 10 min延伸。应用RT-PCR仪自带分析软件，产生PCR扩增曲线。

2 结 果

2.1免疫组化染色观察MT1-MMP在不同病理类型胃癌和癌旁组织中的表达 110例患者中高表达组(>4分)74例，其中腺癌34例，未分化癌13例，黏液癌10例，特殊类型癌17例；Ⅰ期10例，Ⅱ期18例，Ⅲ期22例，Ⅳ期24例。低表达组(≤4分)36例，其中腺癌15例，未分化癌7例，黏液癌6例，特殊类型癌8例，Ⅰ期24例，Ⅱ期11例，Ⅲ期1例，Ⅳ期0例。而瘤旁组织仅有5例呈低表达，其余均未见明显表达(图1)。

2.2RT-PCR检测MT1-MMP mRNA表达 正常黏膜组织与胃癌组织之间MT1-MMP mRNA水平比较具有明显差异，Ⅰ、Ⅱ期胃癌与Ⅲ、Ⅳ期胃癌之间MT1-MMP mRNA水平比较也有统计学意义(P<0.05)。见表1。

A：癌旁组织未见明显表达；

B：Ⅳ期胃癌见明显胞质染色

表1 不同分期胃癌和癌旁组织的MT1-MMP mRNA表达

2.3MT1-MMP表达水平与胃癌临床特征的关系 性别、年龄、出现黑便、呕血、急性腹膜炎等并发症与MT1-MMP表达情况无相关性，而患者肿瘤早期转移、2年复发率及生存率与MT1-MMP表达情况具有一定的相关性。见表2。

表2 MT1-MMP表达情况与临床特征的相关性〔n(%)〕

3 讨 论

目前临床上对于胃癌的治疗主要是采取手术加放化疗的综合治疗方式，但胃大部切除术后，患者往往出现较为严重的并发症。尽管手术可以一定程度上延长患者的生存期，但是多数患者生存质量下降，而放化疗等治疗给患者带来的痛苦则更加明显。

MT1-MMP是膜型MMPs家族中最重要的成员之一，文献报道〔2〕其在肿瘤的侵袭、扩散、细胞增殖及肿瘤新生血管的形成中具有重要的作用。Yu等〔3〕报道MT1-MMP可以通过与不同的细胞因子相互作用而加快肿瘤细胞的迁移，并且这种影响与细胞的类型和细胞外基质的成分无关。MT1-MMP过度表达的转染子还可以促进肿瘤细胞生长，增加癌细胞的侵袭能力、粘附性等，直接决定肿瘤恶性程度和患者生存期限的重要因素〔4〕。肿瘤血管的生成是影响肿瘤生长速率的重要因素，Williams等〔5〕通过体外血管生成模型试验证明MT1-MMP在富含胶原的环境中具有促进内皮细胞侵袭和新生血管生成的作用。

本研究结果显示在肿瘤组织中MT1-MMP均有表达，而在瘤旁组织中呈低表达；而在不同分期的胃癌中，发生远处转移的患者肿瘤中MT1-MMP的表达水平明显高于未发生远处转移的患者。徐涛等〔6〕检测123例肝癌组织，依据肿瘤进展程度分为浸润组和非浸润组，结果显示MT1-MMP在浸润组的表达明显高于对照组，并且浸润组中伴有血清VEGF的升高和肿瘤血管的增加。杨娜等〔7〕也报道MT1-MMP在胶质瘤中的表达明显高于正常脑组织，并且与胶质瘤的分级相关，胶质瘤级别越高MT1-MMP的表达越强烈。姚广裕等〔8〕研究发现，MT1-MMP可显著增强乳腺癌细胞株的浸润能力，其机制主要通过激活MMP-2原酶、降解肿瘤周围的基质成分来实现。

本研究结果提示，肿瘤转移越早、2年内复发、生存期短的患者，胃癌组织中MT1-MMP的表达就越高，这与MT1-MMP在肿瘤组织中的生物学特性密切相关，也提示MT1-MMP不仅在肿瘤细胞株中具有促进肿瘤迁移、增殖、浸润的作用，在实体肿瘤中同样对肿瘤的恶性程度具有影响。

4 参考文献

1刘维生，肖新如，耿会娟，等.胶质瘤中膜型基质金属蛋白酶1mRNA水平表达〔J〕.北京医学，2008;30(1)：1-3.

2Ross AC.All-trans-retinoic acid and the glycolipid α-galactosylceramide combined reduce breast tumor growth and lung metastasis in a 4T1 murine breast tumor model〔J〕. Nutr Cancer,2012;64(8):1219-27.

3Yu X,Zech T,McDonald L,etal. N-WASP coordinates the delivery and F-actin-mediated capture of MT1-MMP at invasive pseudopods〔J〕. J Cell Biol,2012,29;199(3):527-44.

4刘 聪，岳 翔，刘爱国，等. 膜型基质金属蛋白酶1及其诱导因子在结直肠癌中表达与预后的相关性〔J〕.华中科技大学学报，2008;37(2)：161-4.

5Williams BB,Mundell N,Dunlap J,etal.The planar cell polarity protein VANGL2 coordinates remodeling of the extracellular matrix〔J〕. Commun Integr Biol,2012;15(4):325-8.

6徐 涛，李乐平，石玉龙，等.膜型基质金属蛋白酶1在浸润性肝细胞癌组织中的表达及意义〔J〕.中华实验外科杂志，2012;29(1)：80-2.

7杨娜，朱运奎.膜型基质金属蛋白酶1与肿瘤的侵袭和转移的研究进展〔J〕.国际呼吸杂志，2010;30(16)：1021-3.

8姚广裕，曾木圣，林 鹏，等.膜型基质金属蛋白酶1对乳腺癌细胞浸润能力的影响〔J〕.中华肿瘤杂志，2006;28(9)：650-3.