巨噬细胞移动抑制因子在动脉粥样硬化中的作用及法舒地尔对其干预机制

王会春 张欢欢 卢 川 廉银珠 赵慧颖

(吉林大学研究生院，吉林 长春 130021)

动脉粥样硬化(AS)具有慢性炎症的特点，脂质过氧化可促进炎症细胞的黏附和浸润并能刺激炎性细胞表达增加而促进AS的发展。多种氧化型低密度脂蛋白(LDL)浓度升高和高密度脂蛋白(HDL)浓度降低是AS的主要危险因素,氧化应激在AS及其他心脑血管病的发生发展中发挥重要作用，多个研究显示Rho/Rho激酶途径参与了氧化应激的调节〔1，2〕。本实验拟探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)及Rho激酶在AS形成过程中的作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物和分组 健康雄性Wistar大白鼠30只，体重220～250 g，购于吉林大学实验动物中心。随机分为三组：对照组(10只)，给予正常基础饲料、普通饮用水喂养9 w,开始实验后7 d给予假球囊损伤手术；AS组(10只)，给予促进AS的饲料及普通饮用水喂养9 w；实验开始时每只大鼠给予30万U/kg维生素D3右下肢肌肉注射，促进AS饲料是在正常基础饲料的基础上加入2%总胆固醇(TC)、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、维生素D3粉剂(1.25×106U/kg饲料)、3%猪油，开始实验后 7 d行球囊损伤手术，每3周称体重并给予上述剂量的维生素D3右下肢肌肉注射。法舒地尔组(10只)，给予促进AS的饲料及普通饮用水喂养9 w，实验开始时每只大鼠给予30万U/kg体重维生素D3右下肢肌肉注射，开始实验后7 d行球囊损伤手术，球囊损伤后开始给予法舒地尔5 mg/kg，2次/d腹腔注射。每3周称体重并给予上述剂量的维生素D3右下肢肌肉注射。

1.2标本采集 实验开始9 w后，参照球囊损伤的常规方法进行动脉拉伤〔13,14〕，采集各组大鼠动脉血液及1 cm的动脉组织(主动脉弓部)，并立即用4%甲醛溶液固定，用于常规形态学和免疫组织化学检查。将采集到的非抗凝血以3 000 r/min离心15 min，取1 ml分离出的血清，保存于-20℃的冰箱中，用于血脂检测(取材前所有大鼠均禁食24 h)。TC、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)应用全自动生化分析仪(XL20)检测。病理形态学观察包括HE染色、MIF的免疫组织化学检测及Rho激酶的免疫组织化学检测。

1.3主要试剂与仪器 微量移液器(芬兰GILSON公司)，台式低温离心机(上海实验仪器总厂)组织摊片机(德国LEICA公司 型号：HI 1220)，组织包埋机(德国LEICA公司 型号：EG 1150H)，盐酸法舒地尔(川威：Rho激酶抑制剂；天津红日药业有限公司赠予)。MIF一抗，Rho激酶一抗(购自北京博奥森生物工程有限公司)，试剂盒SP-9710和二氨基联苯胺(DAB)(购自福州迈新生物技术开发有限公司)。

2 结 果

2.1实验9 w后各组血脂变化情况比较 AS组TC、LDL-C、TG较对照组和法舒地尔组明显升高，HDL-C明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 实验9 w后各组血脂变化情况

2.2各组HE染色结果比较 图1可见，对照组主动脉壁的内膜、中膜、外膜层次清晰，内皮细胞完整，中层的平滑肌细胞排列正常无增生，外层为疏松结缔组织；AS组血管壁上存在典型的粥样斑块，内膜增厚、纤维化，血管内膜向管腔内突出，斑块内可见泡沫细胞、脂质沉积，内膜可见少量炎性细胞和增生的平滑肌细胞，内弹力板破坏，中膜平滑肌细胞明显增生，并呈灶状或片状钙化；法舒地尔组血管内膜、中膜平滑肌细胞无明显增生，可见少量散在的炎性细胞浸润和泡沫细胞形成。

图1 各组HE染色结果(×200)

2.3各组MIF和Rho激酶表达比较 AS组MIF和Rho激酶较对照组和法舒地尔组明显升高，法舒地尔组MIF和Rho激酶表达较对照组明显升高(P<0.05,P<0.01)。见表2。对照组可见MIF少量，表达少量Rho激酶阳性表达；AS组MIF表达明显增多，大量Rho激酶阳性表达，法舒地尔组可见MIF呈点状表达，Rho激酶在内膜和斑块中呈阳性表达，与AS组比较明显减少。见图2,图3。

表2 各组MIF和Rho激酶表达比较

图2 各组免疫组化染色MIF表达(×200)

图3 各组免疫组化法Rho激酶表达(×400)

3 讨 论

MIF是一种具有细胞因子、神经内分泌激素和酶等生物活性的细胞因子，其主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、激活及分泌一些细胞因子，从而间接增强巨噬细胞的功能〔2〕。实验证实〔3〕，在发生AS的血管处除巨噬细胞外，血管内皮细胞及平滑肌细胞也可以分泌大量MIF，但这些细胞在正常情况下不会产生或仅产生少量MIF，而应用MIF中和抗体及反义核酸技术阻断MIF的表达则可以明显延缓AS的发展，对已经发生的粥样斑块阻断MIF也可以使斑块趋于稳定〔3〕。这表明AS的发生可能与MIF之间存在密切的关系。在人巨噬细胞培养液中加入相同浓度的不同脂质,结果发现不同脂质对巨噬细胞表达MIF mRNA和蛋白水平的影响不同,LDL、氧化型LDL(ox-LDL)、和TG诱导巨噬细胞MIF mRNA和蛋白表达水平比对照组升高,而HDL和极低密度脂蛋白诱导巨噬细胞MIF mRNA和蛋白表达水平与对照组无明显差别。提示,MIF可能参与了LDL、ox-LDL、TC和TG异常所致的AS进程，推测MIF可能是引发AS的重要因素〔4〕。

Rho GTP酶又称小G蛋白，它通过激活其下游靶分子-Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rock)参与多种细胞信号的传递〔5〕。这些靶点蛋白被磷酸化后可激活信号传导通路，导致细胞收缩、内皮受损、血管平滑肌细胞增殖、炎性细胞浸润等，最终促进AS形成。研究中发现，在人类和动物粥样硬化的血管节段Rho激酶mRNA的表达增强，Rho激酶通过多种血管活性物质相互作用，影响平滑肌的功能和结构，直接参与心血管疾病的病理生理过程〔6〕。长期给予Rho激酶抑制剂可以降低AS斑块大小及斑块内炎症细胞的聚集〔7〕。Rho激酶降低内皮细胞的屏障功能，在血管重塑的过程中亦起重要作用〔8〕。

本研究显示MIF 与AS 呈正相关，Ross〔9〕在1993年提出了AS的炎症学说，从炎症角度解释AS斑块的形成过程，在各种损伤因素作用下正常内皮细胞的生物学行为被破坏，内皮细胞通透性增加、细胞表面黏附分子表达增加、内皮抗凝/促凝血平衡失调，促使血液中的单核细胞迁移、浸润到受损的血管内皮下，吞噬ox-LDL后形成细胞源性泡沫细胞。损伤因素持续存在，炎症反应会进一步刺激平滑肌细胞迁移到内膜下，转变成分泌型的平滑肌细胞，分泌胶原和其他的活性分子，斑块体积逐渐增大可向管腔内突出，导致血管狭窄。载脂蛋白区Apo-E基因敲除小鼠在给予高胆固醇饮食喂养后可以形成类似于人类的AS斑块；Fleckenstein等〔10〕结合人类AS斑块的特点，提出了在高脂饮食的基础上加钙超载的方式建立大鼠AS的模型，在损伤大鼠动脉的基础上，给予添加TC、胆酸钠、维生素D3、丙基硫氧嘧啶后的饲料喂养，促进TC等的吸收造成高TC血症，而且在高钙盐的作用下易形成钙化，此AS模型与人类的AS的斑块相似，所以本实验采用大鼠制造AS模型。

本实验表明在AS的形成过程中MIF发挥了一定的作用。另外，说明法舒地尔通过抑制Rho激酶的表达及活性进而抑制MIF的表达发挥其抗AS作用,本研究中发现Rho激酶抑制剂可以通过对MIF表达的干预进而发挥抗AS作用，探讨MIF与Rho激酶在AS过程中可能存在相辅相成作用。

本实验表明法舒地尔有降低血脂的作用，与文献〔11〕报道一致，其抗AS作用可能与其降脂作用有关。他汀类药物因其降脂、稳定粥样斑块等在临床上广泛应用于冠心病患者，多项研究结果表明Rho/Rho激酶信号转导通路参与了他汀类药物多效性的作用机制。他汀类药物可通过抑制异戊烯化调节细胞内小分子单体G蛋白信号转导通路，从而发挥调脂作用及其以外的多效性，而Rho激酶抑制剂法舒地尔可以直接抑制Rho激酶的表达及活性进而产生与他汀类药物相同的降脂及抗AS的作用，但其具体机制尚不完全清楚，仍有待于前瞻性大量临床研究。

4 参考文献

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10Fleckenstein G,Frey M,Luley C,etal. Differentiation between calcium and cholesterol-dominated types of artherosclerotis lesions: antiarteriosclerotic aspects of calcium antagonist 〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,1991;18(6):s1-9.

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