丹黄通络胶囊对自然衰老大鼠学习记忆能力的影响

张小毅 李生莹 刘巨源 杨宇平 詹合琴

(新乡医学院药学院，河南 新乡 453003)

丹黄通络胶囊是经现代科学工艺加工生产的一种中药复方制剂，具有“活血化瘀、益气通络、滋补肝肾”等作用，对改善老年脑血管病变和延缓衰老有较好疗效〔1〕。随着全球人口老龄化的程度加快，老年性痴呆的发病率逐年上升，已成为继心脏病、肿瘤和脑卒中之后的第4大杀手，但其病因、发病机制尚未完全清楚，缺乏有效的西医治疗措施，因此开发利用中药复方，发挥中医优势来治疗该病就十分重要。本研究以丹黄通络胶囊为载体，通过观察其对自然衰老模型大鼠学习记忆的影响，初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 5月龄和20～24月龄健康Wistar大鼠，雌雄各半，体重分别为250～260 g、400～500 g，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。

1.2药品与主要试剂 丹黄通络胶囊(DHTL)：0.48 g/粒，含原生药1.6 g/粒，批号：050526，贵阳天阳生物技术开发有限公司；Aβ1～40单克隆抗体：美国Sigma公司；胆碱乙酰转移酶(ChAT)检测试剂盒和乙酰胆碱酯酶(AchE)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.3主要仪器 Morris水迷宫系统(成都泰盟科技有限公司)；721分光光度计(北京光学仪器厂)；Biomias99图像分析系统(四川大学图像图形研究所)。

1.4动物分组与给药 适应环境1 w后，取Wistar大鼠进行Morris水迷宫训练，淘汰掉学习成绩太好(逃避潜伏期≤5 s)和太差(逃避潜伏期≥40 s)者，其余纳为合格大鼠。将筛选合格的10只5月龄Wistar大鼠作为青年对照组，40只20～24月龄Wistar大鼠随机分为老年模型组、DHTL低、中、高剂量组(0.16，0.32，0.64 g/kg)，每组10只。除青年对照组和老年模型组给予等容量蒸馏水外，其余各给药组按既定剂量灌胃给药，1次/d，连续60 d。

1.5Morris水迷宫实验 各组大鼠在药物干预结束后开始水迷宫实验，该实验包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时4 d，每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练2次，将大鼠面向池壁放入水中，记录120 s内寻找平台所需时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在120 s内仍未找到平台，则将其置于平台上并停留10 s，潜伏期记为120 s。空间探索实验在定位航行实验结束的第2天进行，撤除平台，记录120 s内大鼠在平台象限的游泳时间和游泳距离百分比。

1.6ChAT和AchE活力的测定 空间探索实验检测结束后立即处死大鼠，在冰盘上断头取脑，将右侧脑组织用冰生理盐水冲洗，除去血液，滤纸吸干，电子天平称重。在冰浴下制备10%的脑组织匀浆，用比色法测定各组大鼠脑组织中ChAT、AchE的活力，所有操作严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。

1.7免疫组化法检测大鼠大脑皮质和海马Aβ1～40的表达 将左侧脑组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，制成5 μm厚连续切片，行SABC免疫组化法染色。每只动物取3张切片，每张切片随机取互不重叠的5个视野，在高倍镜下(×400)采用Biomias99图像分析系统检测大鼠大脑皮质和海马中Aβ1～40的平均灰度值(MG)。

2 结 果

2.1DHTL对自然衰老大鼠学习记忆能力的影响 与青年对照组比较，老年模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；而在平台象限的游泳时间和游泳距离百分比均明显降低(P<0.01)，提示老年模型组大鼠学习定位能力显著下降，存在明显的学习记忆功能障碍，表明老年痴呆大鼠模型成功。使用DHTL灌胃后，各给药组大鼠逃避潜伏期均明显缩短；在平台象限的游泳时间和游泳距离百分比则明显增加，且DHTL中、高剂量组与老年模型组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.2DHTL对自然衰老大鼠脑组织中ChAT、AchE活力的影响 老年模型组大鼠脑组织中ChAT活力明显降低，AchE活力显著增强，与青年对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与老年模型组相比，DHTL各剂量组均能显著降低AchE活力(P<0.01)，中、高剂量组还能明显升高ChAT活力(P<0.01)，且具有一定的量效关系。见表2。

2.3DHTL对自然衰老大鼠大脑皮质和海马Aβ1～40表达的影响 免疫组化染色结果显示，老年模型组大鼠大脑皮质、海马神经元胞质呈深染棕黄色颗粒状改变，MG平均灰度值较青年对照组显著降低(P<0.01)；与老年模型组比较，DHTL各剂量组大鼠大脑皮质、海马神经元胞质呈浅染棕黄色颗粒状改变，MG均有不同程度增加(P<0.01)，且呈现明显的剂量依赖关系，结果见图1、图2和表2。

表1 DHTL对自然衰老大鼠水迷宫实验学习记忆能力的影响

表2 DHTL对自然衰老大鼠ChAT、AchE活力及Aβ1～40表达的影响

图1 丹黄通络胶囊对不同组别大鼠海马神经元Aβ1～40表达的影响(×400)

图2 丹黄通络胶囊对不同组别大鼠大脑皮质中Aβ1～40表达的影响(×400)

3 讨 论

AD是发生于老年前期或老年期的一种中枢神经系统退行性疾病，主要表现为学习记忆功能障碍和行为异常〔2，3〕。但是，由于AD的发病机制尚不清楚，目前临床上使用单一靶点的药物很难取得满意疗效，而中药治疗疾病具有多靶点的特性，有广阔的研发前景。本研究所使用的丹黄通络胶囊主要是由丹参、黄芪、银杏叶等五味中药组成的复方制剂，近年来研究表明，丹参制剂及其有效成分能明显抑制AD模型大鼠大脑组织中β-淀粉样蛋白(Aβ)的增高，显著提高ChAT活力，对改善AD大鼠学习记忆功能障碍有较好疗效〔4，5〕；黄芪是补气良药，具有增强机体免疫力和提高衰老小鼠抗氧化物酶活性的作用〔6〕；银杏叶及其提取物能提高中枢胆碱能神经功能，增加脑血流量，减少脑组织耗氧量，具有抗血栓、抗氧化等功能〔7，8〕。本研究发现中、高剂量丹黄通络胶囊能明显缩短大鼠逃避潜伏期，增加其在平台象限的游泳时间和游泳距离百分比，这表明丹黄通络胶囊对自然衰老大鼠的学习和记忆能力有一定的改善作用。

中枢胆碱能系统是形成学习记忆的主要通路，学者普遍认为老年性痴呆的主要原因是中枢胆碱能系统功能不足，并且其临床症状的严重程度和胆碱能系统的活性密切相关〔9〕。乙酰胆碱(Ach)是该系统中一种重要的神经递质，在学习记忆信息的传递中发挥着至关重要的作用。但是由于Ach性质极不稳定，因此极难准确测定其含量，而催化其合成的酶ChAT和促进其分解的酶AchE，他们的活性变化分别能间接反映Ach在脑中合成率和分解率的改变，二者共同维持着Ach的动态平衡。本实验说明丹黄通络胶囊对自然衰老大鼠学习记忆能力的改善作用可能与恢复中枢胆碱能神经系统功能有关。

由于Aβ在水中溶解度较低，且有很强的自聚性，在适宜条件下，能很快聚集成纤维，就产生了神经毒性作用，从而诱发神经元发生凋亡。现代医学已经证实〔10，11〕，各种原因导致的中枢神经系统内淀粉样前体蛋白(APP)的过多表达，以及APP被降解产生过量的Aβ是启动AD发病的关键因素。本实验发现丹黄通络胶囊各剂量组均能显著减少Aβ1～40在自然衰老大鼠大脑皮质和海马中的表达，且具有明显的量效关系，这说明丹黄通络胶囊对自然衰老大鼠学习记忆能力的改善作用可能与降低Aβ沉积有关，但是关于其是否能减少神经元的凋亡及其主要机制，尚在进一步研究中。

4 参考文献

1高秀丽，曹恒仪，王鹏娇.丹黄通络胶囊抗衰老作用的实验研究〔J〕.黑龙江医学，2007；31(10)：749-50.

2茹立强，王才源，殷光甫.神经科学基础〔M〕.北京：清华大学出版社，2004：339-51.

3Drachman DA.Aging of the brain,entropy,and Alzheimer disease〔J〕. Neurology,2006；67(8):1340-52.

4张 妍，林 青，唐民科，等.复方丹参对老年痴呆模型大鼠海马和大脑皮层ChAT、AchE活性的影响〔J〕.北京中医药大学学报，2008；31(3)：192-5.

5李 林，茹立强.丹参酮对D-半乳糖-Aβ1-40致痴呆大鼠海马内Aβ和AChE的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(7)：918-20.

6单玉兴，施溯筠，张善玉.参芪合剂对衰老小鼠抗氧化功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(19)：2509-10.

7刘晓平，栾佳杰，Christopher E，etal.银杏叶提取物双重抗氧化作用的研究〔J〕.中成药，2009；31(7)：1005-9.

8张扩建.银杏叶治疗老年脑血管疾病临床研究〔J〕.中成药，2005；27(9)：1053-5.

9Fassbender K,Masters C,Beyreuther K.Alzheimer′s disease:molecular concepts and therapeutic targets〔J〕.Neurology，2001；55(6)：865-77.

10Tanzi RE,Moir RD,Wagner SL,etal.Alzheimer′s abeis peptide the many roads to perdition〔J〕.Neuron,2004;43(5)：605-8.

11刘春喜.阿尔茨海默病中β-淀粉样蛋白的神经毒性作用〔J〕.上海第二医科大学学报， 2004；24(6)：483-6.