老年大鼠脊髓腰骶段NADPH-d阳性体的表达及睾酮对其影响

徐彦楠 周晨明 张国梁 车 静 石葛明

(河北医科大学细胞生物教研室，河北 石家庄 050017)

脊髓腰骶段主要控制大肠、盆底肌和生殖器官的功能〔1〕。在衰老的过程中，脊髓腰骶段呈现与年龄相关的衰老性变化，同时也出现肠、膀胱和生殖器官等盆腔脏器的器质性和功能性改变。一氧化氮(NO) 是一种重要的神经信息物质，在外周和中枢神经系统中起着重要的信号转导作用〔2〕。有研究显示盆腔脏器的功能或器质异常可能与老年脊髓腰骶段的NO表达改变有关〔3〕。在衰老的过程中脊髓腰骶段的出现NO表达变化，特别是还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸黄递酶(NADPH-d)阳性体的表达改变〔3〕。机体衰老体内性激素减少，NO特别是NADPH-d阳性体的表达变化是否与体内性激素的减少有关目前尚无定论。本实验拟NADPH-d组织化学法，观察老年大鼠脊髓腰骶段NADPH-d阳性体的表达及鼻腔给予睾酮后对其的影响。

1 材料与方法

1.1实验分组和动物模型 选取6月龄和21月龄健康雄性Wistar大鼠15只，由河北医科大学动物实验中心提供。大鼠分为6月龄组、21月龄组和21月龄滴鼻组，每月龄组5只。6月龄组和21月龄组鼻腔给予芝麻油(2 mg/kg)，21月龄滴鼻组鼻腔给予睾酮(2 mg/kg)，连续给药3个月(6月龄组从3月龄时开始给药，21月龄组和21月龄滴鼻组从18月龄开始给药)。

1.2灌注切片 所有大鼠经10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，经左心室灌注固定，取出脊髓后固定4 h(4℃)。取脊髓腰骶段(L6-S1)后置入30%的蔗糖中过夜。在恒冷切片机上进行连续切片，片厚40 μm。

1.3染色 将切片在0.1 mol/L PB缓冲液漂洗两次后。浸入孵育液(孵育液组成：0.3%Triton X-100，1.0 mmol/L β-NADPH，0.2 mmol/L NBT)置于37℃ 90～120 min，缓冲液终止反应，裱片制片。在显微镜下观察计数6月龄组、21月龄组和21月龄滴鼻组分布在后角浅层(SDH)、利绍尔束(LT) 、中间外侧核(ILN) 、DCN和中央管(CC)NADPH-d阳性体的数目。

2 结 果

显微镜下，在NADPH-d染色的方法显色的脊髓腰骶段可以看到被染成蓝色的NOS神经元，细胞呈高尔基样，其胞体和突起清晰可见。并且在21月龄组以及21月龄给滴鼻组均可见高密度球形或不规则形的NADPH-d阳性体。见图1。6月龄组雄性Wistar大鼠脊髓腰骶段未出现NADPH-d阳性体21月龄组老年大鼠脊髓腰骶段出现较多的NADPH-d阳性体，老年大鼠鼻腔给予睾酮后此阳性体数目减少(图1，表1)。而与21月龄组相比，21月龄滴鼻组SDH、LT、ILN、DCN和CC分别减少19%、26%、42%、31%、27%，21月龄滴鼻组与21月龄组差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组NADPH-d染色结果(Bar=100 μm)

表1 21月龄组和21月龄滴鼻组NADPH-d阳性体数目

3 讨 论

本文提示大鼠在衰老过程中NADPH-d阳性体逐渐增多，而睾酮可能能够抑制它的增多。

SDH(Ⅰ层和Ⅱ层)及DCN和ILN分别是内脏伤害性信息向中枢传递以及中枢对外周伤害性信息进行神经调控的主要部位〔4〕。腰骶髓DCN和ILN是位于脊髓的重要核团,它们参与盆腔内脏伤害性信息的传递〔5〕。脊髓腰骶段与肠、膀胱和生殖器官功能障碍联系密切〔7〕。NO是由一氧化氮合酶(NOS)合成，是一种重要的神经递质在外周和中枢神经系统中起着重要的信号转导作用〔2〕。NADPH-d的分布与的NOS分布基本一致，所以可以用NADPH-d 组化技术对中枢神经系统中的NOS进行定位和定量分析。分布在脊髓的大量的NADPH-d阳性神经元参与内脏的调节〔7〕。有研究报道老年大鼠脊髓腰骶部的NADPH-d阳性体数量和分布较成年大鼠增多，并集中在脊髓腰骶部背侧部如：SDH、LT、ILN、DCN、CC等〔3〕，与本研究结果相同。老年大鼠盆腔内脏功能减弱，可能与脊髓腰骶部NADPH-d阳性体的出现有关〔3〕。在衰老的过程中，大鼠的性激素水平逐渐降低。本文显示老年大鼠鼻腔给予睾酮后NADPH-d阳性体数目明显减少，说明睾酮可能抑制了NADPH-d阳性体增多。所以给予睾酮可能会对盆腔内脏的功能起到改善作用。

综上，由NADPH-d阳性体导致的老年人盆腔脏器功能障碍可能与体内性激素水平降低有关，其机制有待进一步研究。

4 参考文献

1Berkley KJ，Hubscher CH，Wall PD.Neuronal responses to stimulation of the cervix，uterus，colon，and skin in the rat spinal cord〔J〕.J Neurophysiol,1993;69(2)：545-56.

2Schuman EM,Madison DV.Nitric oxide and synaptic function〔J〕.Ann Rev Neurosci,1994;17:153-83.

3Tan HB,He JW,Wang SY,etal.Age-related NADPH-diaphorase positive bodies in the lumbosacral spinal cord of age rats〔J〕.Arch Histol Cytol,2006；69(5):297-310.

4季 伟,裴力雨,史 娟，等.5-羟色胺在大鼠腰骶髓后连合核和中间带外侧核参与盆腔内脏炎性调控的形态学研究〔J〕.神经解剖学杂志，2006；(3)：333-6.

5Ding YQ，Zheng HX，Gong LW.Direct projections from the lumbosacral spinal cord to Barrington′s nucleus in the rat：a special reference to micturition reflex〔J〕.J Comp Neurol，1997;389：149-60.

6Berkley KJ.A life of pelvic pain〔J〕.Physiol Behav，2005;86(3)：272-80.

7Doone VG，Pelissier N，Manchester T,etal.Distribution of NADPH-d and nNOS-IR in the thoracolumbar and sacrococcygeal spinal cord of the guinea pig〔J〕.Auton Nerv Syst，1999;77：98-113.