低灌注处理对家兔心肌缺血再灌注损伤的影响

赵 艳 杨鸿雁 刘兴德

(贵阳医学院分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

急性心肌梗死后，成功地再灌注缺血心肌是减少心肌梗死面积、改善临床预后最有效的方法，但同时也会导致附加的缺血/再灌注(I/R)损伤。这种形式造成的损伤可高达最终心肌梗死面积的50%〔1〕，因此I/R损伤的机制及如何减少I/R损伤受到研究者的广泛关注。目前I/R损伤的机制仍未完全阐明，但已证明与氧化应激、钙超载、炎症反应、能量代谢障碍、线粒体通透性转换孔的开放、生理PH值的快速恢复有关。本研究对急性心肌缺血的家兔，在心肌再灌注时给予低灌注处理，探讨低灌注处理对I/R家兔心功能的影响，并进一步探讨低灌注处理对家兔心肌凋亡基因bcl-2、caspase-3表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物与材料 新西兰大白兔 (体重2.5～3.0 kg) ，雌雄不限，由贵阳医学院动物中心购得。Trizol购自Invitrogen，RNAisoTMPlus由大连宝生物公司生产，引物由上海Sangon公司合成，bcl-2一抗采用武汉博士德公司生产的兔多克隆抗体。

1.2家兔心肌I/R模型的制作 自家兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，仰卧固定于实验台。手术分离出右颈总动脉，结扎远端，由近端将自制导管插入左心室，并经压力换能器与多项导联生理记录仪连接，气管插管，连接小型动物呼吸机，呼吸频率40次/min，潮气量15 ml/kg。沿胸骨左缘剪断第3肋骨，暴露心脏，剪开心包，暴露心前血管。从左心耳根部下约3 mm处进针，结扎线穿过浅层心肌横跨前室间沟从肺动脉圆锥旁出针，放置松解拉线后结扎冠脉前降支。结扎成功标准为心电图ST段弓背向上抬高，松开结扎线，提拉松解拉线以恢复冠脉血流，抬高的ST段下降50%以上为再灌注成功。

1.3实验分组 新西兰大白兔雌雄不限16只，随机分为2组各8只，分别给予以下处理：①A组(缺血再灌注组)：结扎LAD30 min，再灌注180 min ，再灌注时予生理盐水10 ml静注5 min；②B组(低灌注处理组)：结扎LAD 30 min，结扎前放置一直径0.7 mm的圆柱形短钢针，再灌注时先抽去钢针使低灌注3 min(20%<血流量<50%)〔2，3〕，然后松解结扎线，同时生理盐水10 ml静注5 min，再灌注180 min。

1.4家兔血流动力学的检测 压力换能器一端与插入左心室导管连接，另一端与多导生理记录仪连接，记录结扎前、结扎30 min、再灌注180 min时LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的变化。

1.5bcl-2蛋白表达检测 处死家兔取左室缺血区心肌，中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，免疫组化法检测bcl-2蛋白表达，心肌细胞质中有棕黄色颗粒者为bcl-2阳性细胞。采用高清晰度彩色病理图像测量系统，在400×视野下，测定平均光密度值作半定量分析。

1.6bcl-2、caspase3 mRNA表达的检测 实验终点，家兔以人道方式处死，取左室缺血区心肌组织，液氮冷冻保存备检。取缺血区心肌50 mg，严格按操作说明提取总RNA，以Oligo dt为引物逆转录成cDNA。家兔管家基因GAPDH为内参，内参及目的基因bcl-2、caspase3引物用primer 5软件设计，引物序列见表1。目的基因与内参在同一体系中进行PCR扩增反应，反应产物进行电泳并对其积分光密度值进行测量，同一泳道上目的基因的积分光密度值与内参积分光密度值之比，为该目的基因相对含量。

2 结 果

2.1低灌注处理对家兔I/R心肌LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的影响 与A组比较，B组的左室内压最大收缩/舒张变化速率(±dp/dtmax)增高(P<0.05)，见表2。

2.2低灌注处理对心肌I/R家兔凋亡基因bcl-2 蛋白表达的影响 与A组比较(151.64±12.53)，B组的bcl-2蛋白表达增高(168.37±15.30，P<0.05) ，见图1。

2.3低灌注处理对心肌I/R家兔凋亡基因bcl-2、caspase-3 mRNA表达的影响 与A组比较，B组的bcl-2 mRNA表达增高(0.81±0.017 vs 0.72±0.021)(P<0.05)，而caspase-3 mRNA表达降低(0.53±0.027 vs 0.62±0.034，P<0.05)， 见图2，图3。

表1 引物序列

表2 低灌注处理对家兔I/R心肌LVSP、LVEDP和±dp/dtmax的影响

图1 两组心肌组织bcl-2蛋白表达(DAB，×400)

图2 家兔心肌I/R bcl-2 mRNA表达

图3 家兔心肌I/R caspase-3 mRNA表达电泳图

3 讨 论

众多基础及临床研究证实缺血预处理、缺血后处理对I/R损伤有保护作用。研究发现缺血后处理可以缩小心肌梗死面积，具有心脏保护作用〔4〕，随后缺血后处理的心肌保护作用在多种动物得到证实。

逐步开通受阻血管为一种改良后处理。范谦等〔5〕在犬I/R模型中经渐处理即逐步恢复冠状动脉血流，50% 2 min、80% 2 min之后再灌注3 h，结果显示与I/R组进行比较，缺血后处理和渐处理均促进再灌注后心功能的恢复，降低再灌注后心律失常的发生，并降低再灌注后血清心肌酶活性，两者差异无统计学意义。渐处理作为一种改良的后处理方式，由于不附加额外的缺血，可能有更广阔的临床应用前景。Musiolik等〔6〕在猪I/R模型中运用指数演算公式，缓慢的增加冠脉回流量超过基线30 min后形成温和再灌注，和直接再灌注组比较，温和再灌注组可缩小心肌梗死面积，但不是通过再灌注损伤的补救激酶(RISK) 途径。Hattori等〔7〕在I/R模型中采用阶段灌注即在开始再灌注的前10 min冠脉血流量维持在闭塞前的20%，然后逐渐释放，再灌注开始20 min后释放完。与直接再灌注组比阶段再灌注组在减少冠脉血流量和减少梗死面积方面无明显差别，但在冠状动脉血流储备方面有保护作用。Akcora等〔8〕研究发现逐步开通受阻血管可提高组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量，减低氧化应激，减小I/R损伤。在此类研究中，无论是在分几步开通、逐步开通时的血流控制及逐步开通所用时间上，研究者逐步开通受阻血管的方法相差很大。

本研究中的低灌注处理为分两步再灌，低灌注处理时间参照缺血后处理定为3 min，低灌注时流量参照兔冬眠心肌模型制作，理论上控制在﹤50%〔2，3〕。本文提示低灌注处理对I/R损伤心肌有保护作用，可能机制是通过上调抑凋亡基因、下调凋亡基因的表达降低细胞凋亡率，减小心肌梗死面积，从而对I/R损伤心肌有保护作用。

4 参考文献

1Yellon DM,Hausenloy DJ.Myocardial reperfusion injury〔J〕.N Engl J Med,2007;3(11):1121-35.

2陈 艳,孙伏清,钟慧颖,等.家兔慢性冬眠心肌模型的建立〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2007;11(34):6777-80.

3Zhao ZQ,Vinten-Johansen J.Postconditioning：reduction of reperfusion-induced injury〔J〕.Cardiovasc Res，2006;70(2):200-11.

4Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME,etal.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285：H579-88.

5范 谦,杨新春,王树岩,等.“渐处理”降低了犬心肌缺血再灌注/损伤〔J〕.中华心血管病杂志,2006;34(4):363-6.

6Musiolik J,van Caster P,Skys Chally A,etal.Reduction of infarct size by gentle reperfusion without activation of reperfusion injury salvage kinases in pigs〔J〕.Cardiovasc Res,2010;85 (1)：110-7.

7Hattori R,Matsui H,Kitano M,etal.Staged reperfusion preserves the coronary flow reserve，especially in the regions not severely damaged by ischemic injury in the canine heart〔J〕.Angiology,1998;49(12):991-1004.

8Akcora B，Altug ME，Balci A,etal.Gradual detorsion of torsioned rat testis attenuatesischemia reperfusion injury〔J〕.J Pediatr Surg,2008;43(10):1879-84.