D-半乳糖加亚硝酸钠建立痴呆症小鼠模型和中药治疗的效果

何 胜 玉 莹 陈菊芳 张 元 潘福玉 李 海 梁雄壮 张树球

(右江民族医学院重金属与氟砷毒物研究实验室，广西 百色 533000)

流行病学调查结果表明我国是世界上痴呆症最多的国家之一〔1〕。由于它的病因、发病机制尚未清楚，因而尚无根治的药物，已引起世界医学界的关注及各国政府的重视。为研究疾病、发病机制和治疗药物，文献中已建立有多种方法的动物模型，各有优点和不足〔2〕。本室陈莉等〔3〕也用何首乌制剂对D-半乳糖加亚硝酸钠联合造模小鼠进行治疗实验,获得了较好的结果,但没有进一步作大脑形态学变化的研究。本文仍用D-半乳糖加亚硝酸钠联合给小鼠皮下注射，建立动物模型后并将中药复方首乌口服液和海尔福口服液分别用灌胃的方法给予治疗，测定造模前后记忆能力变化,结束时测定血清和脑匀浆的生化指标及脑组织形态学变化。

1 材料与方法

1.1试剂 D-半乳糖、亚硝酸钠、氯化钠，均为国产分析纯。乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测试盒、总巯基(-SH)测试盒、甘油三酯(TG)测试盒、总胆固醇(TC)测试盒、钙离子测试盒，购自南京建成生物工程研究所和四川省迈克科技有限责任公司。

1.2中药 海尔福口服液，由银花、茯苓、甘草等中药提取制成。复方首乌口服液，由何首乌(制)、龙眼肉提取制成。均由本院海尔福研究中心提供。

1.3实验动物及分组 选用昆明种小白鼠48只，鼠龄2个月，健康，雌雄各半，分成四个组，每组12只。即正常组、模型组、治疗1组、治疗2组。分笼喂养，雌雄分开，每笼6只，小鼠编号，称体重。由学院动物室提供。

1.4AD模型的建立及治疗 模型组、治疗1组、治疗2组均为造模组。D-半乳糖用生理盐水溶解，配成9.8 mg/ml浓度，滤膜过滤除菌。放4℃冰箱保存待用。D-半乳糖按每天100 mg/kg体重剂量、亚硝酸钠按45 mg/kg体重剂量〔3〕，两溶液混合后作颈后皮下注射，每天1次，连续45天结束。造模到2 w后，治疗组开始治疗，治疗1组用海尔福口服液，取原液0.2 ml用蒸馏水稀释至0.4 ml灌胃，每天1次；治疗2组用复方首乌口服液，取原液0.2 ml用蒸馏水稀释至0.4 ml灌胃，每日1次。模型组和正常组用等体积的蒸馏水代替，方法相同，直至实验结束。

1.5测定方法 AchE根据本酶催化乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，胆碱可与巯基显色剂反应生成对称三硝基苯(TNB)黄色化合物，颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量反映一线胆碱酯酶的活力。具体操作参考试剂盒说明书。GSH-PX活力测定根据GSH-PX催化过氧化氢(H2O2)与还原型谷胱甘肽(GSH)反应，用GSH被消耗的量来计算GSH-PX活力，具体操作参考试剂盒说明书。-SH测定用巯基显色剂显色反应(黄色)，412 nm波长比色测定。钙离子测定利用钙离子与甲基百里香酚蓝(MTB)结合，生成蓝色络合物，比色测定。TG用GPO-PAP法、TC用COD-CE-PAP法测定，具体操作参考试剂和说明书。水迷宫游水时间测定，利用y型水迷宫，开始预先训练5天，每天游水训练3次，使其熟悉上岸地点(逃命)，计算下水到达上岸地点时间(s)和错误率。统计时把超过10 s以上按10 s计，参考文献〔4〕。

1.6统计学处理 数据用SPSS10.0统计学软件进行方差分析，Q检验。

2 结 果

2.1各组-SH,AchE,GSH-PX测定结果 治疗1组脑-SH活性最高，其余3组差异不明显； AchE活性最低是模型组，最高正常组； GSH-PX活性最高是正常组，最低是模型组。见表1。

2.2血清TC,TG,脑钙含量 模型组TG明显高于治疗1组(P<0.05)；TC治疗2组明显高于其他组。脑钙含量治疗组明显升高。见表2。

表1 各组-SH,AchE，GSH-PX水平比较

表2 血清TC,TG,脑钙含量比较

2.3小鼠造模前后水迷宫游水时间 造模前后水迷宫游水时间各组间无显著差异(P>0.05),但造模后时间均缩短了；错误率除模型组没有降低外,其他均显著降低。见表3。

表3 造模前后水迷宫游水时间比较

2.4大脑皮质病理切片检查结果 图1可见，对照组的大脑皮质的分子层、外颗粒层、外锥体层和内颗粒光镜层分界清楚，颗粒细胞数量和体积正常，胞质的尼氏体丰富。模型组大脑皮质分层不清楚颗粒细胞数量明显减少，胞质的尼氏体也减少，有较多的神经元萎缩、变性和凋亡。治疗组的病理改变得到很好改善，颗粒细胞数量增多，神经元胞质尼氏体也增多，其中治疗2组病理改变得到改善最为明显。

图1 各组大鼠大脑皮质病理学观察(HE，×200)

3 讨 论

在AD的病因学中和发病机制中，胆碱能损伤学说是目前较为公认的，老年痴呆症大脑的胆碱能学说发生严重的溃变，引起老年性学习记忆减退和认知障碍，产生痴呆症状。正常基底前脑的胆碱能神经元(主要位于基底核、斜角带核和内侧隔核)合成大量乙酰胆碱能投射纤维输送到海马和大脑皮质。乙酰胆碱被认为与学习和记忆有关。在发生AD时，基底前脑的胆碱能神经元丢失，造成乙酰胆碱的合成、储存、释放减少，从而导致以记忆和识别功能障碍为主的多种临床表现，同时测定AchE活性降低〔1〕，额叶、顶叶皮质中胆碱含量也会明显降低。

自由基损伤学说也是AD的病因学和发病机制的重要学说。自由基是外层轨道具有不配对电子的原子、分子式基团，具有化学活性强、连锁反应的特点。正常情况下，人体氧代谢过程中产生低浓度生理范围的自由基，但若产生过多或清除能力减弱，就会对机体造成伤害。自由基损伤生物膜会造成细胞内环境紊乱，导致细胞老化、死亡。自由基损伤脂类产生过氧化，过氧化脂质分解时可产生丙二醛等醛类，与磷酸、蛋白结合形成脂褐素，沉积于脑导致智力障碍。

本实验AD模型组小鼠大脑AchE活性明显降低。正常组、治疗1组、治疗2组AchE酶活性明显高于模型组，其中复方首乌治疗2组更接近正常组，效果更明显。研究表明〔5〕，大脑学习记忆能力与胆碱能神经系统有密切关系，乙酰胆碱是此系统重要的神经递质，它由乙酰胆碱转移酶(CAT)催化合成，释放后作用于M-受体，发挥生理功能后，又被AchE催化分解成胆碱和乙酸，保持一种动态平衡，是认知功能得以正常发挥。AD患者脑组织中，由于神经细胞功能减退、酶活力及记忆力、认知能力减退，其机制仍不十分清楚。目前在病理形态方面发现患者大脑中存在的老年斑和神经纤维缠结，是研究的热点。老年斑中存在大量不溶性的β淀粉折叠蛋白，是由于可溶性的α螺旋空间构象转变成不溶性β-折叠构象，这是一种机制不十分明了的空间构象的转变的形式。另一方面是神经纤维变性、缠结，机理也不明了。本实验结果表明，模型组在D-半乳糖和亚硝酸钠联合作用下，AchE活力明显降低，病理形态学也发生一定的改变,与文献报道一致〔6〕。而用复方首乌治疗2组，TchE活力恢复较好，接近正常组，已有研究表明，何首乌含二苯乙烯，是其有效成分之一，对AD有较好的治疗作用〔7〕。治疗1组用海尔福口服液，其功能是排毒作用，并有较好的自由基清除能力，因而也有一定的恢复酶活力。

脑组织GSH-PX活力，模型组明显低于正常组和复方首乌口服液治疗2组。GSH-PX是催化过氧化氢(H2O2)与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成水(H2O)H和氧化型谷胱甘肽(G-S-S-G)的酶类，从而清除代谢过程中产的H2O2，是机体清除活性氧(包括 ·OH和H2O2等)的主要抗氧化酶类，对机体具有保护作用。本实验表明其抗氧化功能提高，对大脑功能也有保护作用，治1组用海尔福口服液治疗后，GSH-PX活力也有一定的提高，同时本组-SH含量也明显高于其他各组，-SH是机体抗氧化功能的重要成分，对机体也有保护作用。总的说明治疗组均有较强的抗氧化功能，对大脑保护较好。

在AD的神经细胞中，磷酸戊糖途径被激活，大量产生NADPH，促进GSH和自由硫基产生，这些分子都是细胞对抗氧化的关键。另外，一些抗氧化蛋白，如SOD、过氧化氢酶、GSH-PX等在病人海马中有所升高，以利于自由基的清除。

钙代谢自体平衡失调与脑老化或老年痴呆的关系，近年来已引起广泛的关注〔1〕。许多研究表明，细胞内Ca2+浓度过高会使钙依赖性生理生化反应超常运转、耗竭ATP、产生自由基，甚至引起细胞死亡。对AD的研究发现，在会有神经元纤维缠结(NFT)的细胞可见到Ca+的堆积。其堆积可能有几个途径，一是外源性Ca2+的内流增加，在神经递质合成、释放异常情况下，引起钙通道开放，胞外的Ca2+大量进入细胞；另一原因可能是内源性Ca2+释放增加，细胞器内储存有大量的钙，称钙库，大量释放到胞质。

4 参考文献

1常 艳,薛毅拢.阿尔茨海默病的发病机制及其研究进展〔J〕.中国临床康复，2004；8(4)：693-5.

2张宝弟，郭 雄.铝致阿尔茨海默病的分子机制〔J〕.国外医学·地理分册，2003；24(1)：16-8.

3陈 莉，刘小艳，黄日越，等.乌圆补血口服液对D-半乳糖和亚硝酸钠所致痴呆症模型小鼠生化指标的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(10):1206-8.

4张树球,黄秋艳,李朝敢，等.用Y型水迷宫测定锌与海尔福口服液对铅染毒所致小鼠记忆障碍的改善作用〔J〕.中国冶金工业医学杂志,2006；23(5):546-8.

5官 斌，李玉梅，马 骏，等.不同工艺制品的补肾中药对痴呆小鼠乙酰胆碱酯酶活性和M-受体功能的影响〔J〕.标记免疫分析与临床，1997；4(3):152-6.

6李 海,玉 莹,杨彩梅，等.铝致小鼠大脑形态与功能的变化及中药治疗〔J〕.中国工业医学杂志,2011；24(1):40-2.

7刘汝臣.铝中毒与Alzheimr病及其治疗药物〔J〕.山东医药工业，2004；26(11)：498-9.