全身振动对去卵巢大鼠骨组织血管内皮生长因子蛋白表达的影响

司会群 卜淑敏 赵俊勇 文思敏 段晓丽

(首都体育学院，北京 100191)

骨质疏松多发生于绝经后女性和老年男性〔1，2〕。雌激素替代疗法是临床治疗绝经后骨质疏松的常用方法，在一定程度上能缓解骨质疏松症状，但也会给身体其他系统带来不良反应，出现不可耐受的副作用。国内外已有很多关于非药物疗法预防及治疗绝经后骨质疏松的研究。国外学者研究已证实，全身振动刺激可防治妇女绝经后骨质疏松〔3〕,但机制还不清楚。虽然研究表明血管内皮生长因子(VEGF)作为最有效的促血管生长因子参与骨形成和骨吸收过程〔4，5〕，但全身振动刺激在治疗绝经后骨质疏松过程中是否影响骨组织VEGF蛋白的表达，目前笔者查阅文献还未见报道。鉴此，本研究采用全身振动干预手段，观察全身垂直振动刺激对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织VEGF蛋白表达的影响，旨在为探讨绝经后骨质疏松振动疗法的作用机制提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 36只3月龄健康雌性未孕SD大鼠，体重(260±12)g，由北京维通利华实验动物中心提供并饲养〔动物合格证号SCXK (京)2006-0008〕，标准啮齿类动物饲料，自由饮水和进食，使用3R实验动物原则给予人道关怀。

1.2动物手术与分组 大鼠适应饲养1 w后，按体重随机分为假手术组(Sham,12只)，去卵巢组(24只)。各组大鼠在手术前均禁食12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,去卵巢组从背部切除双侧卵巢,假手术组只切除卵巢旁与卵巢等大的一块脂肪组织。无菌手术在北京大学医学部实验动物科学部进行。术后自由饮水进食,1 w后按体重将去卵巢组大鼠随机分为去卵巢静止组(OVX,12只)和去卵巢振动组(WBV,12只)。在实验进行过程中，2只DVX组大鼠因腹部粘连而死亡，最后纳入实验的各组大鼠数目分别为：假手术组12只，OVX组10只，WBV组12只。

1.3全身振动方案 手术后第10周，用XR-36型双能X线骨密度仪(DEXA)检测去卵巢两组大鼠的腰椎骨密度，确定骨密度已经下降后，WBV组大鼠先在振动台上适应性振动训练1 w，1次/d，15 min/次,振动加速度为3.8 g，频率为90 Hz，7次/w。从第11周开始进行正式全身振动，2次/d，振动频率和加速度不变。所有振动实验均在上午进行，正式振动处理时间为7 w。

1.4全身骨密度检测 实验结束时，按腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，麻醉后将大鼠俯卧在DEXA测量平台上，在小动物模式下扫描各大鼠全身和主要部位骨密度。

1.5骨标本的采集 各组大鼠取材前均禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后腹主动脉取血处死。根据大鼠解剖位置截取第3腰椎、股骨远端和胫骨近端并剥离干净，液氮冻存，用以提取总蛋白。

1.6Western 印迹检测VEGF蛋白表达水平 将骨组织在液氮中迅速研磨成粉末，取200 g粉末加入1 ml含PMSF的组织裂解液静置于冰上2 h，4℃，12 000 r/min离心30 min。取上清液与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)按照4∶1混合，沸水浴5 min后即刻放置在冰上冷却，分装后-40℃保存。取15 μl蛋白样品上样，在10%SDS-Page凝胶中电泳。电泳结束后，在80 V电压下转膜2 h，然后在质量分数为5%的脱脂奶粉液中封闭2 h，加一抗(Mouse-抗-VEGF;Rabbit-抗-β-actin,)4℃过夜；次日，将膜用TBST洗3次，10 min/次，加入TBST稀释的二抗(马抗小鼠IgG/磷酸酶标记和山羊抗兔IgG/磷酸酶标记)室温孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次；用BCIP/NBT化学显色至出现条带，蒸馏水终止显色，拍照，用Quatity One软件扫描各条带灰度值后进行定量分析。

2 结果

2.1各组大鼠在体骨密度的比较 OVX组大鼠第5腰椎、股骨远端和胫骨近端骨密度显著低于sham组大鼠(P<0.01或P<0.001)，而全身骨密度无显著性差异(P>0.05)；WBV组大鼠胫骨近端骨密度显著高于OVX组(P<0.01)，而其他部位骨密度无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠在体骨密度的比较

2.2各组大鼠骨组织VEGF蛋白表达的比较 与Sham组比较，OVX组胫骨近端骨组织VEGF蛋白表达显著下降(P<0.01)，而股骨远端和腰椎无显著性差异(P>0.05)；与OVX组比较，WBV组腰椎、股骨远端和胫骨近端VEGF蛋白表达均显著增加(P<0.05或P<0.01)。见图1。

与Sham组比较：1)P<0.05;与OVX组比较：2)P<0.05;3)P<0.01

3 讨论

近几年来，运用物理疗法来防治骨质疏松已成为研究热点〔6，7〕。机械强度低于引起骨组织损伤的振动信号不仅可以防止骨丢失，还能改善骨结构，具有很强的促进骨形成的效应，是一种具有应用前景的治疗骨质疏松的物理疗法〔8〕。

前期实验显示，大鼠的腰椎和股骨松质骨骨密度在去卵巢8 w时会显著降低〔9〕。本实验表明骨质疏松模型建立成功。并且全身振动能部位依赖性地改善去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度。Judex等〔10〕的研究结果与本研究结果一致。Rubinacci等〔12〕报道振动对胫骨和脊柱骨密度影响不同可能是因为胫骨和脊柱中雌激素受体分配不同引起。与本实验研究结果类似，即振动刺激对胫骨骨密度的影响显著大于对腰椎骨密度的影响，可能是振动刺激明显增加了胫骨中雌激素受体的数量，从而显著增加了骨密度。

VEGF作为体内最强的血管内皮生成因子，一方面通过血管化参与骨代谢，另一方面，VEGF还直接参与成骨和破骨作用，已被看作为一种骨代谢调节因子〔12，13〕。破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成间的偶联促使骨量转换处于动态变化中，血管的生成在此耦联机制中起着关键作用〔14〕。Ichiro〔12〕研究发现，大鼠去势后VEGF的表达减少，其结果与本实验结果相似，结果提示，振动刺激可能是通过促进去卵巢骨质疏松大鼠骨组织VEGF蛋白的表达而刺激成骨细胞形成进而促进骨的重建。李鹏彪〔15〕研究发现，雌激素可促进成骨细胞VEGF的表达，潘晋平〔16〕研究也发现，适当浓度雌激素能促进成骨细胞VEGF的表达，说明VEGF是雌激素调节骨代谢的机制之一。至于振动是否通过雌激素促进去卵巢骨质疏松大鼠骨组织VEGF蛋白的表达还有待实验进一步证实。

4 参考文献

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4Kohno S,Kaku M,Kawata T,etal.Neutralizing effects of an anti-vaacular endothelial growth factor antibody on tooth movement〔J〕.Angle Orthod,2005；75(5):797-804.

5Zhang Q,Guo R.VEGF-C,a lymphatic growth factor,is a RANKL target an autocrine mechanism 〔J〕.J Biol Chem,2008;283:13491-9.

6陈建庭，邓轩赓，冯 鹰，等.复合振动治疗卵巢切除大鼠骨质疏松的初步试验研究〔J〕.中国老年学杂志，2008；28(9)：842-4.

7Rubinacci AM，Arenzanz M，Cavani F,etal.Ovariectcmy sensitizes rat cortical bone to while-body vibration〔J〕.Calcif Tissue Int,2008;82(4):316-26.

8Jordan J.Good vibrations and strong bones〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005;288(3):R555-6.

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10Judex S,Lei X,Han D，etal.Low- magnitude mechanical signal that stimulate bone formation in the ovariectomized rat are dependent on the applied frequency but not on the stain magnitude〔J〕.Biomech,2007;40:1333-9.

11Rubinacci A,Marenzana M,Cavani F，etal.Ovariectomy sensitizes rat cortical bone to whole-body vibration〔J〕.Calcif Tissue Int,2008;82: 316-26.

12Ichiro K,Shumpei N,Mitsuhiro S,etal.Estrogen regulates the prodiction of VEGF for osteoclast formation and activity in op/op mice〔J〕.Joumal of Bone and Mineral Research,2004;2: 200.

13Maes C,Carmeliet P,Moermans K,etal.Impaired angiogenesis and endochondral bone formation in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188〔J〕.Mech Dev,2002;111(1-2):61-73.

14Cai DJ,Zhao Y,Glasier J,etal.Comparative effect of soy protein,soy isoflavones,and 17β-estradiol on bone metabolism in adult ovariectomized rats 〔J〕.Bone Miner Res,2005;20: 828-39.

15李鹏彪,尹芸生等.雌激素对骨质疏松大鼠骨折愈合过程成骨细胞血管内皮生长因子表达的影响〔J〕.中国药物与临床，2010；10(8):321-3.

16潘晋平.雌激素对成骨细胞血管内皮生长因子表达的影响〔D〕.山西医科大学，2010:3.