小干扰RNA抑制MDM2对HepG2细胞的影响及机制

赵燕颖 李亚刚 赵春燕 杨泽成 张舵舵 孙远杰

(吉林大学第四临床医院内科，吉林 长春 130011)

肝癌存在多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活、突变,最终导致其编码蛋白质的改变,从而引起细胞恶变〔1〕。MDM2的基因产物可以和野生型p53(wtp53)结合，可以起到一种对p53的负调节作用，因为MDM2基因的过度表达，可以减少p53基因的抑癌作用，即使是低水平MDM2的表达，也将会引起细胞成瘤性的增强〔2〕。目前已有大量研究表明在消化系统肿瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌中MDM2都是过渡表达的〔3〕。siRNA技术已经成为研究基因功能的一种公认的有效工具,并且可以用于筛选药物靶点,为治疗肿瘤、病毒感染带来突破。目前尚未见用siRNA技术干扰MDM2表达对人肝癌细胞的报道。本文作者设计siRNA MDM2并转染人肝癌细胞,观察其对细胞增殖和凋亡的影响和对MDM2及其上下游基因蛋白的表达影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 胎牛血清、IMDM培养基 (Gibco);Trizol Reagent，逆转录和PCR试剂盒(Invitrogen)、SilencerTMsiRNA construction kit(Ambion 公司);LipofectamineTM2000 转染试剂盒(Invitrogen公司)；引物由上海生工生物技术公司合成；细胞株(中国科学院上海细胞所)。兔抗人MDM2、wtp53、p21、Bcl-2和β-actin抗体及羊抗兔二抗购于UPSTATE，Hybond 硝酸纤维素膜 (NC) 购自Amersham。

1.2siRNA 的设计和合成 根据已知Gen Bank MDM2 mRNA序列和siRNA的设计原则〔4〕,利用Ambion 公司的在线设计来寻找靶序列,并做同源序列搜索,排除那些和其他编码序列或表达序列标签(EST)同源的序列,用SilencerTMsiRNA construction kit体外合成siMDM2-1，siMDM2-2,阴性对照(control siRNA)购于Ambion,与任何编码序列无同源性。

1.3细胞培养及转染 人肝癌细胞HepG2细胞株由中科院上海细胞所提供。在含10%小牛血清的IMDM培养液中培养,于5%CO2和37℃条件下培养。HepG2细胞采用脂质体LipofectamineTM2000进行转染。取对数生长期的HepG2细胞用0.25 %胰酶消化后,制成单细胞悬液,用细胞记数板进行细胞记数。取96孔板和10 ml培养瓶。96孔板每个培养皿接种细胞数为1×104,培养瓶接种1×106，37℃,5%CO2条件下培养24 h后进行转染。做好分组标志(Ⅰ组：PGCsilencerTM-MDM2 siRNA-1;Ⅱ组：PGCsilencerTM-MDM2 siRNA-2；Ⅲ组：PGCsilencerTM-control siRNA；Ⅳ组:只加转染试剂lipofectin)。转染步骤依据LipofectamineTM2000转染说明书。

1.4RT-PCR检测siMDM2对细胞基因的影响 转染后72 h用Trizol 提取各组细胞中的总RNA。总RNA中逆转录出cDNA,再通过PCR法扩增，操作均严格按试剂盒说明书进行。以β-actin作为内参，MDM2扩增产物为300 bp，上游5′-AACCACCTCACAGATTCCAG-3′，下游5′-TCAAGGTGACACCTGTTCTC-3′；p53扩增引物为490 bp，上游5′-GTGGTGGTGCCCTATGAG -3′；下游5′-GGGAGGTAGACTGACCCTTT-3′;P21扩增产物为486 bp，上游5′-GCTGAGCCGCGACTGTGAT-3′下游5′-TGAGACTAAGGCAGAAGATGTA-3′；Bcl2扩增产物为382 bp，上游5′-GACCGAAGTCCGCAGAAC-3′，下游5′-CCAACGTGCCATGTGCTA-3′;β-actin 扩增产物为 520 bp，上游:5′-GGGACCTGACAGACTACCT-3′，下游：5′-CGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶系统电泳(含溴乙啶)，拍照鉴定。用Pharmacia ImageMaster 凝胶成像仪观察,并用 ImageMaster 软件分析条带峰面积,转染各组信号值相对于对照组的百分率进行统计作图。

1.5MTT法检测siMDM2对细胞增殖的影响 转染siMDM-1、2和control siRNA,每组4复孔,培养24，48，72 h 后每孔加入5 g/ L MTT 溶液15 μl，37℃孵箱中继续孵育4 h后吸弃孔内培养上清液,每孔加150 μl二甲基亚砜(DMSO),振荡10 min，用酶联免疫检测仪570 nm测定各孔吸光度,记录结果。以时间、吸光度绘制细胞增殖曲线,细胞增殖抑制率(%)=(1-处理组吸光度/未处理组吸光度)×100%,计算出抑制率。

1.6流式细胞仪检测siMDM2对细胞凋亡的影响 转染后继续培养72 h后收集各组的HepG2细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,70%冰乙醇固定,碘化丙啶染色,流式细胞仪检测。通过软件Multicycle进行分析,以DNA含量为横坐标,受检细胞为纵坐标作图,用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。G1峰前面出现的亚2倍体峰即为凋亡峰，计算各组凋亡率。

1.7划痕实验检测siMDM2对细胞迁移能力的影响 将HepG2细胞种于24孔培养板中，用含10%胎牛血清(FBS)的IMDM培养基常规培养。次日待细胞融合度达到80%～90%时,用中号枪头进行划痕，PBS洗3次以去除划下的细胞，加入新鲜的培养液，转染，培养48 h。荧光显微镜拍照纪录。比较转染前后划痕宽度的变化。

2 结 果

2.1重组质粒酶切和测序鉴定 PGCsilencerTM-MDM2 siRNA经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后呈2条带,分成大的载体片段和小的目的片段。将重组质粒PGCsilencerTM-MDM2-siRNA送上海生工测序(测序号D02.CS060503093_0253.SD13D229-1.F；D04.CS060503093_0255.SD13D230-1.F),引物序列根据载体序列,采用Primer-Premier5.0设计为：5′-AAGAAGAGAGTGTGGAATCTA-3′。结果表明siRNA表达模板成功构建于PGCsilencer载体上,序列完全正确,与目的序列相同。见图1。

1:Marker;2:siMDM2-1;3:siMDM2-1/HindⅢ+BamHⅠ;4:siMDM2-2;5:siMDM2-2/HindⅢ+BamHⅠ;6:control siRNA;7：control siRNA / Hind Ⅲ+ BamH Ⅰ;8:Marker

2.2siMDM2转染后细胞基因表达的变化 以β-actin作为内参照,对靶基因mRNA进行RT-PCR结果定性定量分析，各组引物的扩增基因片段经电泳和HE染色后,结果显示扩增片段大小与所设计的大小完全一致。siMDM2-1，2对基因表达影响趋势一致，转染2组siMDM2后MDM2和Bcl2 mRNA表达水平有显著的下调,p53和p21 mRNA表达水平有显著上调，而转染阴性质粒组各基因表达水平无明显改变。半定量扫描分析,和空白组比较转染2组si-MDM2的HepG2中MDM2 mRNA的表达量平均下调61.7%;p53 mRNA表达量平均上调46.9%；p21 mRNA表达量平均上调41.8%；Bcl2 mRNA平均下调39.5%，和空白组比均具有显著性差异(P<0.05,n=4)； control siRNA组各基因表达量与空白对照组无明显差异(P>0.05,n=4)。见图2。

2.3siMDM2 转染后细胞增殖的变化 MTT法检测显示转染siMDM2后HepG2细胞增殖受到不同程度的抑制，转染2组si MDM2后24、48、72 h的平均抑制率为(30.9±2.99)%、(45.6±3.15)%和(52.1±3.29)%。抑制率随时间的增加而增高，各转染组抑制率明显高于control siRNA组，control siRNA组细胞增殖未见明显改变。而且siMDM2-1组抑制率稍高于siMDM2-2组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4siMDM2转染后细胞凋亡的变化 转染siMDM2可以诱导HepG2细胞凋亡，转染2组siMDM2的细胞凋亡率分别为(41.9±2.59)%和(34.9±1.98)%，明显高于control siRNA组(2.6±0.39)%(P<0.05)。同时，和空白组比siMDM2组细胞处于S期的细胞比例明显减少;而处于G0/G1期的细胞比例明显增加。

2.5siMDM2转染后细胞迁移能力的变化 control组与control siRNA组迁移较快，而siMDM2组迁移速率变慢，control组与control siRNA组之间差异无显著性(P>0.05)，各组siMDM2之间差异无显著性(P>0.05)。siMDM2组迁移距离与空白组和control siRNA组相比，差异有显著性意义(P<0.05)。见图3。

图2 转染后各组MDM2、P53、P21和Bcl2基因表达的变化

图3 转染后HepG2细胞迁移能力的变化

3 讨 论

目前原癌基因、抑癌基因、凋亡基因等癌症相关基因的过度表达被认为是肝癌发生的主要原因。一些研究表明，可以用RNAi技术抑制原癌基因，突变的抑癌基因，细胞周期相关基因，抗凋亡相关基因等的表达来抑制肝癌的发生和发展〔1〕。肝癌的发生是多基因参与的结果，随着肝癌分子机制研究的不断深入，可成为RNAi技术靶位点的基因也越来越多，因此，如能利用RNAi技术抑制癌基因的表达，从而影响上下游基因表达变化，就可能抑制肝癌的发生和发展。

MDM2作为一种癌基因,其生物学作用是增强细胞的增殖活力,使细胞生存期延长,促进细胞增生及肿瘤的生长〔5〕。MDM2能与p53结合,抑制p53的抑癌功能。p53和Bcl-2同属于细胞凋亡的重要调控因子,在调节细胞凋亡的过程中有相互联系、共同作用的关系〔6〕。Farah等〔7〕认为p53基因诱导细胞凋亡的机制可能为：降低细胞内源性Bcl-2蛋白表达和抑制其功能,p53基因与Bcl-2蛋白表达呈明显负相关。另外，MDM2蛋白还可以与p21结合,终止p21被p53活化的抑制细胞增生的作用〔8，9〕。P21是ras基因家族中一种共同表达产物,是细胞周期负性调控基因,可被野生型p53蛋白诱导表达而使细胞周期停滞于G1期。MDM2过表达可以下调p53和p21表达，上调Bcl-2的表达从而刺激细胞无限制性生长,这可能在某些肿瘤的发生及发展中起着关健性作用。

本文结果显示siMDM2可抑制MDM2基因的表达从而促进p53表达，最终导致p21表达增加和Bcl-2表达降低，这可能是siMDM2抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡的主要机制之一。

本课题组在siRNA MDM2对前列腺癌增殖和凋亡的影响研究基础上〔10〕，对干扰MDM2在肝癌治疗中作用的进一步研究。研究结果基本一致，进一步证明了本研究组设计合成的siRNA MDM2质粒可以抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，同时可以抑制肿瘤细胞的迁移能力。siRNA技术为肿瘤基因治疗提供了一个新的可供选择的策略和技术平台,本研究亦表明MDM2可能是肿瘤治疗的一个新的靶点。

4 参考文献

1Zeng XX，Zheng RL，Zhou T,etal.Novl thienopyridine derivatives as specific anti- hepatocellular carcinoma (HCC) agents：synthesis，preliminary structure-activity relationships，and in vitro biological evaluation〔J〕.Bioorg Med Chem Lett，2010；20(21)：6281-5.

2Akkiz H，Sümbül AT,Bayram S,etal.MDM2 promoter polymorphism is associated with increased susceptibility to hepatocellular carcinoma in Turkish population〔J〕.Cancer Epidemiol，2010；34(4):448-52.

3Kang KF，Zhang X，Chen XW,etal.Expressions of MDM2 and MMP-7 in normal liver，cirrhosis，hepatocellular carcinoma tissues〔J〕.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2010；18(1):67-8.

4Elbashir SM，Harborth J，Weber K，etal.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs〔J〕.Methods，2002；26(2)：199-213.

5刘冬满，何世东，张志勇.子宫内膜癌中p15及MDM2蛋白表达〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(4):1936-7.

6Esposito F，Tornincasa M，Chieffi P,etal.High-mobility group A1 proteins regulate p53- mediated transcription of Bcl-2 gene〔J〕.Cancer Res，2010;70(13):5379-88.

7Farah IO，Begum RA，Ishaque AB，etal.Differential protection and transactivation of P53，P21，Bcl2，PCNA，cyclin G，and MDM2 genes in rat liver and the HepG2 cell line upon exposure to pifithrin〔J〕.Biomed Sci Instrum，2007;43:116-21.

8Rong JJ，Hu R，Song XM,etal.Gambogic acid triggers DNA damage signaling that induces p53/p21(Waf1/CIP1) activation through the ATR-Chk1 pathway〔J〕.Cancer Lett，2010；296(1):55-64.

9Xu H，Zhang Z，Li M,etal.MDM2 promotes proteasomal degradation of p21Waf1 via a conformation change〔J〕.J Biol Chem，2010;285(24):18407-14.

10李然伟，赵燕颖，杨泽城,等.siRNA抑制人前列腺癌细胞PC3的MDM2表达及细胞增殖〔J〕.肿瘤防治研究，2009；36(1):24-7.