左卡尼汀强化St.Thomas No.2液对老年大鼠离体供心冷保存的影响

周 涛 向道康 秦国伟

(贵州省人民医院心血管外科，贵州 贵阳 550002)

供心质量是影响心脏移植手术成功的重要因素，也与术后远期存活率密切相关〔1〕，供心保存的安全时限和保存方法是保证供心质量的关键，供心保存液的研究一直是心脏移植关注的热点。左卡尼汀(LCN)广泛分布于机体各种组织细胞中，是细胞能量代谢的重要调节因子，其作用是携带长链脂酰CoA通过线粒体内膜，促进三羧酸循环正常进行，协助细胞维持生理活动所需的能量生成，对心肌代谢途径的调节具有非常重要的作用。我们早期的研究表明〔2〕使用含LCN的心脏停搏液可减轻心肌线粒体的脂质过氧化反应，对心肌细胞有较好的保护作用；进一步研究提示添加LCN的心脏停搏液可以减轻冷保存大鼠心肌线粒体的钙超载，减轻心肌的氧化损伤，改善心肌的能量代谢，提高低温离体心脏的保存效果〔3〕。本文利用Langendorff 灌注装置建立老年大鼠离体心脏灌注模型，探讨左卡尼汀强化St.Thomas No.2液对冷保存老年大鼠供心保存效果的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1动物分组及模型的建立〔3〕健康SD老年大鼠(20月龄)24只，雌雄各12只，使用随机数字表法随机分成3组,每组 8只，对照组组采用 St.Thomas No.2 液，主要成分(mmol/L)：氯化钠120、氯化钾16、氯化镁16.6、氯化钙1.2、碳酸氢钠10，pH7.8，作为心脏停搏液并作为保存液保存心脏6 h，LCN1组、 LCN2组采用St.Thomas No.2液分别添加6、12 g/L LCN为心脏停搏液和保存液保存心脏6 h。

模型建立参考文献〔4〕，老年大鼠称重后腹腔注射肝素钠抗凝，使用乌拉坦麻醉平稳后胸骨正中开胸，摘除心脏置入 4℃的K-H缓冲液中，冲洗主动脉内残留血液，主动脉根部修剪后插入主动脉插管，与 Langendorff 装置连接， K-H 缓冲液以灌注压维持在90 cmH2O压力、37℃恒温灌流进行灌注，肺动脉根部切开以使冠状动脉回流液充分引流。K-H缓冲液使用时新鲜配制，并经48 μm的过滤器过滤，灌注前给予95% O2和 5% CO2混合气体按 1.5 L/min向储液瓶内的灌流液中通气30 min，平衡15 min左右心脏搏动达到稳定状态，血流动力学平稳后测定血流动力学相关指标值,逐渐降低灌注温度至 30℃以下，按分组经主动脉根部分别灌注不同的心脏停搏液使心脏停搏，取下停跳心脏，根据分组不同在相应的心脏保存液中分别保存6 h，重新开始心脏灌注，逐渐恢复灌注温度至 37℃。

1.2实验仪器与试剂 使用Langendorff离体心脏灌流装置，美国AD Instruments公司ML870型PowerLab多导生理记录仪，丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所，其他试剂均为国产分析纯试剂；LCN(商品名贝康亭)广州贝氏药业有限公司产品。

1.3标本采集及指标检测 测定复灌至心脏复跳时间，在灌注恢复30 min、60 min后测定各血流动力学指标值，记录心率(HR)、冠脉流量(CF)、左心室收缩峰压 (LVSPP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)，各项指标的恢复率按(保存后数值/保存前数值)×100%计算；灌注恢复30 min后取冠状动脉流出液测定心肌酶乳酸脱氢酶(LDH)及磷酸肌酸激酶(CK)，LDH及CK使用全自动生化分析仪测定；心脏灌注恢复60 min后取2块左心室心肌组织，一块称湿重后放入100℃的烘箱中烘烤，24 h后称干重，按(湿重-干重)/湿重×100%计算心肌含水量，另一块使用硫代巴比妥法测定MDA含量。

2 结 果

2.1心脏复跳时间及心功能指标的变化比较 各组离体心脏在冷保存6 h后均能成功复跳，对照组、LCN 1组和LCN 2组复跳时间依次为(85.31±12.09)s、(81.54±11.43)s和(79.80±13.47)s，见表1，三组之间比较无差异(P>0.05)。

2.2心肌含水量及MDA、心肌酶比较 三组心肌含水量比较，对照组〔(85.41±9.11)%〕较LCN 1组〔(77.09±7.21)%〕和LCN 2组〔(71.41±8.02)%〕高，LCN1组较LCN2高(P<0.05)；三组间MDA以对照组最高(P<0.05)，LCN1 、LCN2组比较无差别(P>0.05)；心肌酶CK、LDH浓度三组间比较差异有统计学意义(P<0.05),其中对照组漏出量最多(P<0.05)，LCN2组和LCN1组间比较，LCN1组较LCN2组漏出量较多(P<0.05)。见表1。

2.3心功能指标的变化 心脏灌注30 min时：LCN 2、LCN1组HR、CF恢复率较对照组高(P<0.05)， LVSPP和+dp/dtmax恢复率与对照组差异无统计学意义(P>0.05)， LCN2组和LCN1组间比较HR、CF 、LVSPP和+dp/dtmax恢复率恢复率差异无统计学意义(P>0.05)。心脏灌注60 min时：LCN1组LVSPP和+dp/dtmax恢复率恢复率较对照组高(P<0.05)，HR 、CF与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，LCN2组HR、 CF 、LVSPP和+dp/dtmax恢复率较LCN1组和对照组高(P<0.05)。见表2。

表1 各组心脏保存后心肌酶漏出量的情况

表2 各组心功能指标的变化比较

3 讨 论

在器官移植手术中，器官保存液对于供体的保护作用至关重要，目前关于供体心脏保存液的类型及其灌注方法的选择，国内外尚无统一标准〔5〕。 St.Thomas No.2液是最为经典也是目前临床运用最广泛的晶体心脏停搏液，在心脏移植的基础研究和临床使用上也有重要地位〔6〕，因此本研究使用St.Thomas液进行研究。低温保存仍是目前最常用和最简便的供体保存方法，当前各种器官保存液对器官保存的安全时间均有一定的限制，移植心脏保存的临床安全期限一般为 4～6 h，因此本实验设定保存离体心脏时限为6 h，对于老年供体心脏而言，本身不同的心肌结构特点以及可能存在的能量代谢障碍，对于保存质量的要求更为严格，左卡尼汀作为参与组织细胞能量代谢的重要物质，添加至St.Thomas No.2液中是否对老年心肌的保存有一定益处值得研究，本实验观察添加左卡尼汀对离体老年大鼠心脏低温保存的效果，以观察左卡尼可否改善St.Thomas No.2液对老年心肌的保存作用。

本实验结果表明LCN添加入传统的 St.Thomas No.2液配方中后，可以减轻离体心肌的损伤，心肌结构和心脏功能可以得到较好的保护，显示出对老年大鼠离体心脏更好地保存效果，而且本研究同时表明，添加较大剂量的左卡尼汀组具有更好的保护效果。

移植早期心功能不全最主要的原因是移植心脏存在的缺血再灌注损伤，心肌缺血再灌注过程中氧自出基产生增加，自由基攻击细胞内不饱和脂肪酸产生脂质过氧化反应，MDA是该反应过程的中间代谢产物，它的产生与脂质过氧化相平行，可反映机体内脂质过氧化程度，其水平高低可间接反映细胞受氧自由基攻击的严重程度。已有研究证实，LCN作为一种有效的氧自由基清除剂，在缓解氧化应激、减少脂质过氧化中均具有明显的保护作用。本研究表明，使用添加LCN St.Thomas No.2液可以使再灌注心脏MDA产生减少，表明LCN可作为氧自由基清除剂减轻保存离体老年心脏恢复灌注时自由基损伤，可能为LCN对冷保存离体老年心脏具有保护作用的原因之一。

通常认为心肌缺血再灌注损伤过程是一种代谢失衡，心肌能量代谢障碍是心肌缺血再灌注损伤发生的重要因素。LCN是人体能量代谢中必需的天然物质，在心肌的能量代谢中起重要作用〔7〕，同时LCN可以通过增加能量的产生而提高缺血缺氧组织的耐受能力。在体外循环心内直视手术中心脏停搏液添加一定量的LCN可以提供足够量的游离卡尼汀，促进线粒体呼吸功能的恢复，改善缺血再灌注时的能量代谢障碍，优化心肌细胞能量代谢，减少缺血再灌注损伤，有助于减轻心肌细胞的损伤，促进心功能恢复〔2〕；我们早期的研究〔3〕表明LCN添加至St.Thomas No.2液可减轻长时间冷保存心肌线粒体钙超载，改善线粒体呼吸功能，减轻三磷酸腺苷的降低，改善心肌能量代谢，对心肌细胞线粒体有较好的保护作用〔7〕，因此，在本实验中添加LCN的心脏保存液可能有助于冷保存离体老年大鼠心脏能量代谢平衡，减少后继的心肌缺血再灌注损伤，从而具有心肌保护效果。

4 参考文献

1Goldsmith KA,Demiris N，Gooi JH,etal.Life-years gained by reducing donor heart ischemic times〔J〕.Transplantation，2009;87:243-8.

2向道康,阎兴治,杨世虞,等.左卡尼汀对体外循环心瓣膜替换术心肌的保护作用〔J〕.中华医学杂志,2003;83(21):1887-90.

3周 涛,向道康,秦国伟.左卡尼汀强化St.Thomas No.2液对长时间冷保存离体心脏能量代谢的影响〔J〕.中国心血管病研究,2010;8 (11)：851-4.

4Oyanagi E,Yano H,Kato Y,etal.L-Carnitine suppresses oleic acid-induced membrane permeability transition of mitochondria〔J〕.Cell Biochem Funct，2008;26(7):778-86.

5Lee S,Huang CS,Kawamura T,etal.Histidine-tryptophan-ketoglutarate or celsior：which is more suitable for cold preservation for cardiac grafts from older donors〔J〕?Ann Thorac Surg，2011；91(3):755-63.

6黑飞龙,王仕刚,于 坤,等.心脏移植心肌保护策略〔J〕.中国体外循环杂志,2009;7(3):166-8.

7Makrecka M，Kuka J，Liepinsh E,etal.The regulation of mitochondrial energy metabolism by L-carnitine lowering agents in ischaemia-reperfusion injury〔J〕.Heart，2011;97(24):e8.