HDPR1对结直肠癌细胞迁徙和侵袭能力的影响

周忠笑 魏晰麟 姚建茹 张 健 边 刚 李金晖

(沈阳医学院奉天医院普外三科，辽宁 沈阳 110024)

结直肠癌是世界上高发恶性肿瘤之一，多半起源于腺瘤,但是其发生的分子机制尚不十分清楚〔1〕。HDPR1基因以及其同系物参与胚胎生长和发育的调控〔2,3〕。然而关于HDPR1在人类疾病中所发挥的作用知之甚少。生物信息学分析显示HDPR1mRNA的表达存在于羊膜、胎儿脑、眼睛、心脏、成人脑脊髓、胃印戒细胞癌、RER阳性结肠癌、急性淋巴细胞白血病、软骨肉瘤等〔4〕。目前认为HDPR1基因是一个潜在的肿瘤相关基因〔5〕。然而，HDPR1在结直肠癌中的表达模式和功能机制尚未阐明清楚。本研究通过检测HDPR1在结直肠癌中的表达情况，以及探讨HDPR1的表达对结直肠癌细胞系的迁徙和侵袭的调控作用。

1 材料与方法

1.1细胞株与细胞培养 人结直肠腺癌瘤株HCT-116为本实验室保存。用含有10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的McCoy's 5A培养液(购自SIGMA)，在37℃ 含5%CO2的饱和湿度培养箱内传代培养。

1.2siRNA转染 使用HDPRl siRNA(Santa Cruz，USA)和阴性对照contol siRNA(Santa Cruz，USA)用特异性siRNA转染试剂(Santa Cruz，USA) 按说明书推荐比例转染至相应细胞，48 h后进行后续实时PCR检测。

1.3实时PCR 应用Trizol (QIAGEN，德国)从组织或者细胞系里抽提总RNA。使用AMV反转录酶和随机引物(Takara)将总RNA合成cDNA。HDPR1进行实时PCR的上游引物：5'-AAAGGGCTTCTGAGGAACGG-3'和下游： 5'- TCAGAGAAGGTATCCCGCCA-3' 为 (124 bp,1155-1278,NM_001079520.1)，以及GAPDH的实时PCR上游引物：5'-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3'和下游：5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'为(158 bp,376-533,NM_001256799.1)。实时PCR过程按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 试剂盒(Takara)的说明书进行。

1.4Western蛋白印迹杂交 利用RIPA裂解液提取蛋白。用BCA试剂盒(Pierce)蛋白定量后取100 μg蛋白样品经10%的SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到Hybond膜(Amersham，德国)上，用5%脱脂奶粉(含0.1%Tween20的TBS即TBST配制)室温封闭2 h。一抗HDPR1抗体(sigma，美国；1∶1 000)孵育4℃过夜，TBST洗3次，加入辣根过氧化物酶标记到羊抗兔-IgG(DAKO；1∶1000)于室温孵育2 h。通过Amersham ECL-Plus(德国)反应后X光片曝光。

1.5细胞迁移能力的检测 转染后48 h，取各组细胞，用胰酶消化后，用无血清的McCoy's 5A培养基调整细胞浓度为5×105个/ml，取0.4 ml细胞悬液接种于Transwell小室(购自BD Bioscience)上层，下层加入含20%胎牛血清的培养基，于37℃，5%CO2条件下培养24 h 后，取出小室隔膜，用棉签擦掉上面未穿过膜的细胞，风干后用100%甲醇固定，吉姆萨染料染色， 在倒置显微镜下观察拍照、计数。随机取10个视野，计数迁移细胞数并计算均值，试验重复至少3次。

1.6细胞侵袭能力的检测 将基质胶matrigel(购自BD Bioscience) 按1∶8 的比例用无血清McCoy's 5A稀释后，取35 μl包被小室的上室，紫外灯照射过夜，其余步骤同迁徙实验。

2 结 果

2.1HDPR1在人的直结肠癌中过表达 HDPR1 mRNA的水平(1.54±0.33)与相应的癌旁黏膜(1.0)比较在直结肠癌样本中明显升高(P<0.05)。应用Western印迹进一步证实高水平的HDPR1蛋白表达出现在直结肠癌中(P<0.05)。见图1。

N：癌旁正常黏膜组织；C：直结肠癌组织

2.2HDPR1 siRNA沉默内源性HDPR1表达 通过在HCT116转染HDPR1 siRNA，沉默内源性HDPR1表达。实时PCR结果显示48 h后HDPR1 siRNA转染组，HDPR1 mRNA水平较阴性对照明显降低〔(0.232±0.079) vs (1.035±0.088)，P<0.05〕，以空白对照为1。

2.3DHPR1 siRNA对HCT116细胞迁移、侵袭能力的影响 转染48 h后，HDPR1 siRNA转染组细胞的穿膜细胞数(15.765±2.0)明显低于阴性对照组(49.5±4.0)和HCT116(空白对照)组(50.099±5.8)(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。转染48 h后，HCT116(空白对照)细胞数为23.76； Mock(阴性对照)细胞数为22.098 7； HDPR1 siRNA转染组细胞数为5.876 5；可见HDPR1 siRNA转染组细胞的穿膜细胞数(5.88±1.0)明显低于阴性对照组(22.09±2.68)和空白对照组(23.16±3.89)(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

HDPR1是Dapper家族的成员，是Wnt通路重要的调控因子〔8〕。HDPR1在结直肠癌中也可能起到重要的作用。HDPR1在侵袭的乳腺癌中上调〔9〕，以及HDPR1在食管癌中高表达并且与临床病理因素相关，免疫组化显示胞浆中高表达的HDPR1与局部的淋巴结转移程度成正相关。这些研究与我们的研究结果HDPR1在人的直结肠癌中高表达一致。然而，也有文献报道〔5～7〕HDPR1在肝细胞癌和肺癌中表达下调，与本研究趋势相反。本研究进一步发现HDPR1的高表达可以增强HCT116的迁徙和侵袭能力。与在肺癌细胞中HDPRl的表达下调可通过下调p120ctn蛋白分子的稳定性和(或)间接上调β-catenin的表达，从而促进肺癌细胞侵袭能力的结论也相反〔7〕。以上研究均提示HDPR1发挥作用可能依赖于细胞所处的环境。

综上，HDPR1在结直肠癌中高表达，并且可以促进结直肠癌细胞系HCT116的迁徙和侵袭。HDPR1促进结直肠癌细胞侵袭转移的分子机制还有待于更多实验进行探索，但随着该研究的深入，将有利于揭示结直肠癌的侵袭转移的机制，为抗肿瘤药物的研发提供了一定的理论基础和实验依据，并寻找可能的防治靶点，从而进行相关的基因治疗。

4 参考文献

1Jemal A,Siegel R,Ward E,etal. Cancer statistics,2008〔J〕. CA Cancer J Clin,2008;58(2):71-96.

2Cheyette BN,Waxman JS,Miller JR,etal. Dapper,a Dishevelled-associated antagonist of beta-catenin and JNK signaling,is required for notochord formation〔J〕. Dev Cell,2002;2(4):449-61.

3Gillhouse M,Wagner Nyholm M,Hikasa H,etal. Two Frodo/Dapper homologs are expressed in the developing brain and mesoderm of zebrafish〔J〕. Dev Dyn，2004;230(3):403-9.

4Katoh M.Identification and characterization of rat Dact1 and Dact2 genes in silico〔J〕. Int J Mol Med，2005;15(6):1045-9.

5Yau TO,Chan CY,Chan KL,etal. HDPR1,a novel inhibitor of the WNT/beta-catenin signaling,is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma: involvement of methylation-mediated gene silencing〔J〕. Oncogene，2005；24(9):1607-14.

6Hou J,Li EM,Shen JH,etal. Cytoplasmic HDPR1 is involved in regional lymph node metastasis and tumor development via beta-catenin accumulation in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕. J Histochem Cytochem，2011;59(7):711-8.

7Yang ZQ,Zhao Y,Liu Y,etal. Downregulation of HDPR1 is associated with poor prognosis and affects expression levels of p120-catenin and beta-catenin in nonsmall cell lung cancer〔J〕. Mol Carcinog，2010;49(5):508-19.

8Gao X,Wen J,Zhang L,etal. Dapper1 is a nucleocytoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus〔J〕. J Biol Chem. 2008;283(51):35679-88.

9Schuetz CS,Bonin M,Clare SE,etal. Progression-specific genes identified by expression profiling of matched ductal carcinomas in situ and invasive breast tumors,combining laser capture microdissection and oligonucleotide microarray analysis〔J〕. Cancer Res,2006;66(10):5278-6.