褪黑素对阿尔茨海默病小鼠模型钙离子昼夜节律的调节作用及机制

梁一波 刘衍宇 邓玉丽 张 衍 叶志东 罗 虹 关俊文

(湛江市第二人民医院临床时间医学实验室，广东 湛江 524003)

阿尔茨海默病(AD)患者的脑组织常发生一系列病理改变，特别是海马β-淀粉样蛋白(Aβ)等自由基明显增多，神经细胞变性、坏死，AD可以使机体的生物节律消失，其中静息-活动近日节律的紊乱就是其中的一个具体表现〔1〕。褪黑素(MT) 是由大脑松果体分泌的一种神经内分泌激素,有抗脑细胞损伤作用,是神经细胞抗氧化作用较强的活性物质之一〔2〕，AD 病人脑脊液中MT水平低下，脑室壁和海马Aβ沉积及钙化斑形成等神经毒性作用可能是AD发病的重要途径，MT可能通过对Aβ自由基的调控，发挥钙子离对脑组织的保护作用〔3〕。本文探讨MT对小鼠自主活动近日节律和认知能力的调节作用。

1 材料与方法

1.1仪器和试剂 DW-5脑立体定位仪、ZZ小鼠自主活动测试仪、200-Morris水迷宫购自四川成都泰盟科技有限公司、贝克曼LD20生化分析仪及上海科华生物制品公司试剂盒；Aβ1-42，Sigma 公司产品,用无菌生理盐水将其溶解稀释成1 μg/μl，放置于4℃冰箱备用。MT，Sigma 公司产品,临用前用无水乙醇溶解,再加生理盐水配制,乙醇终浓度为5%。

1.2实验动物分组 BALB/c小鼠，体重(18±2) g,由广东医学院动物实验中心供给。随机分为3组，即AD模型组(AD组)、褪黑素调节组(MT组)、假手术组(NS组)，每组各24只。具体处理如下：①MT组：右侧脑室注入Aβ1～422 μl，术后3 d再用MT 5 mg/kg腹腔注射连续10 d。②AD组：右侧脑室注入Aβ1～422 μl，术后3 d再用等量5 %乙醇生理盐水腹腔注射连续10 d。③NS组右侧脑室注入人工脑脊液2 μl，术后3 d再用等量5%乙醇生理盐水腹腔注射连续10 d。

1.3模型制作 用0.45%戊巴比妥钠10 ml/kg麻醉小鼠，将其固定于脑立体定位仪上，头顶部备皮、络合碘消毒后切开小鼠颅顶皮肤，暴露颅骨，参照小鼠脑立体定位图谱〔4〕，用牙科钻钻一小孔定位于右侧脑室前囟点后1 mm，中线旁开2 mm处，深2.5 mm，通过脑立体定位仪与微量注射器缓慢注入Aβ1～422 μl留针5 min，术后常规饲养。

1.4标本制作 术后2 w进行行为学测验，然后每组小鼠24 h内，每隔4 h随机取出4只，摘眼球取血液分离血清，断头后迅速取脑组织匀浆高速离心取上清液，把血清和脑浆上清液编号-20℃保存待测。

1.5测定指标 ①自主活动节律分析：用ZZ小鼠自主活动测试仪，在全亮环境下自主饮食，每3 min记录1次小鼠活动次数，共记录7 d。②认知能力：采用Morris水迷宫测试认知能力。实验前训练3 d，先将小鼠置于水迷宫中自由游泳2 min，以适应水迷宫的环境，训练2次/d，120 s/次，每次训练间隔30 min，选择平台的对角象限中环入水，将小鼠面朝池壁放入水池，任其游泳直至找到平台。正式实验为1 d，每组小鼠连续24 h里每隔4 h测试1次，小鼠寻找平台的时间和轨迹，由Morris水迷宫视频跟踪系统自动记录各组小鼠逃避潜伏期及到达平台全程，其数量大小与小鼠空间学习记忆成绩负相关。③所有血清和脑浆上清液标本同批测定，用生化分析仪测定各组标本钙离子浓度。

2 结 果

2.1MT对AD模型小鼠自主活动近日节律的调节 小鼠侧脑室注Aβ1～42术后第14天，放入ZZ小鼠自主活动测试仪检测各组小鼠的自主活动度。NS组小鼠自主活动近日节律明显，AD模型组小鼠自主活动度近日节律消失，表明Aβ1～42对小鼠的活动度有显著的影响，使其静息-活动的近日节律紊乱，MT组小鼠的近日节律再现，只是时相有变,提示MT可改善Aβ1～42所致AD小鼠的自主活动近日节律。见图1。

2.2MT对AD模型小鼠空间学习记忆能力的调节 用Morris水迷宫视频跟踪系统检测各组小鼠1 d的6个时点(0：00、4：00、8：00、12：00、16：00、20：00)的空间学习记忆能力变化趋势。NS组与MT组空间学习记忆能力的平均潜伏期昼夜变化均呈明显波动结构，存在近日节律,且潜伏期短；而AD组平均潜伏期变化几乎平直，近日节律消失。组间两因素方差分析,AD组小鼠平均潜伏期较NS组与MT组显著延长(P<0.01)，上述结果提示，AD组小鼠学习记忆能力差；MT可显著改善AD模型小鼠学习记忆近日节律。见表1。

2.3MT对AD模型小鼠血清及脑室钙含量的调节 在行为检测结束后,3组小鼠在一天6个时点(0：00、4：00、8：00、12：00、16：00、20：00、22：00)，各组随机抽4个小鼠摘眼球取血液并立即断头取脑匀浆离心，取上清液用生化分析仪测定钙的含量，结果NS组小鼠与MT组小鼠血清及脑钙离子浓度昼夜变化存在近日节律，AD组小鼠近日节律消失。与NS组和MT组比较,AD组小鼠各时点血清钙显著下降(P<0.01)，脑组织钙显著上升(P<0.01) 。NS组与MT组12：00、16：00时点血清钙和8：00、12：00、20：00时点脑浆钙水平比较无统计学意义(P>0.05)，表明Aβ1～42可诱发大脑组织钙化增加；MT对Aβ1～42诱发大脑组织钙化有对抗作用。见表2。

图1 各组小鼠第7天自主活动直方图

与MT组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

表2 各组小鼠血清和脑浆昼夜6个不同时点钙浓度

3 讨 论

生物节律是许多生物体固有的以昼夜周期性变化为基础的一种生命属性，其中以近日节律最为显著，某些疾病发生、发展与生物节律变化密切相关。已有实验证明Aβ是各种原因诱发AD的共同通路，AD加速松果体的退行性变，加重松果体的钙化程度，松果体的细胞也显著减少，这些病理改变均可影响机体的生物节律〔5〕。MT是体内最强的自由基清除剂，具有对抗Aβ神经毒性作用，MT能抑制氧自由基链式反应、保护细胞脂质膜的完整性，从而维持细胞内钙调节系统的平衡，避免因为细胞内的钙超载而造成的细胞死亡〔3〕。作为第二信使，钙离子控制许多生理过程。静息状态下胞浆中Ca2+水平很低，细胞内外的Ca2+浓度差大，Ca2+可通过胞浆上的Ca2+通道或胞内Ca2+库的释放通道提高胞浆中Ca2+浓度，从而引起各种生理活动〔6〕。Ruthrich等〔7〕用摘除松果体制作AD小鼠模型，结果显示海马Ca2+浓度异常增高，同时伴有小鼠海马神经元凋亡增多，从而证实松果体的主要激素MT可抑制细胞内Ca2+的升高提出Ca2+可能参与了AD患者神经元细胞死亡过程，他们发现过多的Ca2+进入神经元会导致细胞死亡。

本研究采用Aβ注入脑室制作AD小鼠模型并以MT干预，结果表明，Aβ与嗜神经细胞依赖性钙离子受体结合引发Ca2+内流，最终导致神经元功能障碍， AD小鼠模型昼夜活动近日节律消失。MT能明显减少AD小鼠的异常活动，并显著改善神经元损害造成的自主活动和学习记忆能力近日节律，MT组与AD组相比学习记忆能力明显改善，近日节律再现，其机制可能是MT抑制脑细胞Ca2+内流以发挥抗AD作用。

4 参考文献

1Gormanl MR,Yellon S.Lifespan daily locomotor activity rhythms in a mouse model of amyloid-induced neuropathology〔J〕.Chronobiol Int,2010;27(6)：59-77.

2Reiter RJ.Melatonin：an antioxidant in edible plants〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2002;957:341-4.

3Chen P. Electrosprayionization tandem mass spectrometry in high-through put screening of homogeneous catalysts〔J〕.Angew Chem Int Ed Eng1,2003;42(25):2832-47.

4Keith BJ，Franklin GP.The mouse brain in stereotaxic coordinates〔M〕. USA：Academic Press，1997：35.

5Brunner P，Szer-Topcular N,Jockers R,etal.Pineal and cortical melatonin receptors MT1and MT2 are decreased in Alzheimer′s disease〔J〕.Eur J Histochem，2006;50(4):311-6.

6Kishiyama MM，Yonelinas AP，Lazzara MM，etal.The von Restorff effect in amnesia：the contribution of the hippocampal system to novelty- related memory enhancements〔J〕.J Cogn Neurosci,2004;16(1):15-23.

7Ruthrich HL，Krug M.Conditioning hypoxia causes protection against ischemia in the CA 1-region of hippocampal slices〔J〕.Restor Neurol Neurosci,1999;15(4):327-35.